吳茱萸堿對缺氧微環境下膽囊癌細胞增殖及HIF-1α、VEGF表達的影響

徐智 劉春燕 溫娟 劉紹華

[摘要] 目的 探討吳茱萸堿對缺氧微環境下膽囊癌細胞（GBC-SD）增殖及缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、血管內皮生長因子（VEGF）表達的影響。 方法 以3%O2、5%CO2模擬缺氧微環境，將GBC-SD分為正常對照組、缺氧組、吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組，分別置于常氧和缺氧微環境下培養。MTT法檢測各組12、24、48、72、96 h細胞增殖能力;Annexin V-FITC/PI雙染流式法檢測各組細胞凋亡情況;Western blot檢測各組細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達狀況。 結果 MTT結果顯示：12 h三組間細胞的光密度值比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;24、48、72、96 h缺氧組細胞的光密度值低于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）;24、48、72、96 h吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組細胞的光密度值低于缺氧組，差異有統計學意義（P < 0.05）。流式細胞結果顯示：缺氧組細胞凋亡率高于正常對照組（P < 0.05）;吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組的細胞凋亡率高于正常對照組和缺氧組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組細胞內HIF-1α、VEGF的蛋白表達均低于正常對照組和缺氧組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。 結論 吳茱萸堿能夠抑制缺氧微環境下GBC-SD增殖，并促進細胞凋亡，這可能與吳茱萸堿抑制腫瘤細胞內的HIF-1α和VEGF的表達有關。

[關鍵詞] 吳茱萸堿;膽囊癌;缺氧誘導因子1α;血管內皮生長因子

[中圖分類號] R735.8? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（b）-0030-04

Effects of evodotaxine on the proliferation of gallbladder carcinoma cells and the expression of HIF-1α and VEGF in anoxic microenvironment

XU Zhi1? ?LIU Chunyan2? ?WEN Juan1? ?LIU Shaohua3

1.Department of Clinical Medicine， Pingxiang Health Vocational College， Jiangxi Province， Pingxiang? ?337000， China; 2.Department of Nursing， Pingxiang Health Vocational College， Jiangxi Province， Pingxiang? ?337000， China; 3.Department of Hepatobiliary Surgery， Pingxiang People′s Hospital， Jiangxi Province， Pingxiang? ?337000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of evodotaxine on the proliferation of gallbladder carcinoma cells （CBC-SD） and the expression of hypoxia-inducing factor 1α （HIF-1α） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in GBC-SD in anoxic microenvironment. Methods Using 3%O2 and 5%CO2 to simulate anoxic microenvironment， CBC-SD cells were divided into normal control group， hypoxic group and evodotaxine （100 μg/mL） + hypoxic group， they were cultured in normal and hypoxic microenvironments. MTT assay was used to detect the proliferation of 12， 24， 48， 72 and 96 h cells in each group. Annexin V-FITC/PI double staining flow method was used to detect apoptosis in each group. HIF-1α， VEGF protein expression was detected by Western blot. Results MTT results showed that there was no statistically significant difference in the optical density values between the three groups at 12 h （P > 0.05）. At 24， 48， 72 and 96 h， the optical density of the hypoxia group was lower than that of the normal control group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. At 24， 48， 72， and 96 h， the light density value of evodotaxine （100 μg/mL） + hypoxia group was lower than that of the hypoxia group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Flow cytometry results showed that the apoptosis rate of hypoxia group was higher than that of normal control group （P < 0.05）. The apoptosis rate of evodotaxine （100 μg/mL） + hypoxia group was higher than that of normal control group and hypoxia group， and the difference was statistically significant （all P < 0.05）. The protein expression of the HIF-1α， VEGF in the cells of the evodotaxine （100 μg/mL） + anoxic group was lower than that of the normal control group and the hypoxic group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion Evodotaxine can inhibit the proliferation of GBC-SD cells in gallbladder cancer under hypoxic microenvironment and promote apoptosis， which may be related to evodotaxine′s inhibition of HIF-1α and VEGF expression in tumor cells.

[Key words] Evodiamine; Gallbladder carcinoma; Hypoxia-inducing factor 1α; Vascular endothelial growth factor

膽囊癌是膽道系統最常見的惡性腫瘤之一，近年來該病的發生率和死亡率均有明顯上升趨勢[1-2]。長期以來，膽囊癌因其發病隱匿、病情進展迅速、手術切除率較低等特點，使該病在早期診斷及治療方面沒有取得有效進展，加之手術及放化療的效果不理想，患者預后不佳[3]。因此，急需尋找一種有效治療膽囊癌的方法。

吳茱萸堿是中藥吳茱萸的有效成分，它不僅能調節免疫，同時也能抑制腫瘤增殖，促進腫瘤凋亡[4-5]，但其具體的抗腫瘤分子機制仍不明確。本研究采用人膽囊癌細胞（GBC-SD）作為研究對象，探討吳茱萸堿對GBC-SD增殖的影響及相關分子機制，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料與細胞培養

DMEM培養基（Hyclone，貨號：SH30022.01）;胎牛血清（GIBCO，貨號：42F7180K）;Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（Biolegend）;血管內皮生長因子（VEGF）兔抗人多克隆抗體（Abclonal，貨號：A2556）;缺氧誘導因子1α（HIF-1α）鼠抗人多克隆抗體（Abcam，貨號：Ab113642），胰酶（Genview，貨號：89040101100），MTT（Genview，貨號：298-93-1）。熒光倒置顯微鏡（日本Nikon），流式細胞儀（美國BD），酶標儀（美國Thermo Labsystems），化學發光儀（上海勤翔）。GBC-SD（購于中國科學院細胞庫）置于含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃飽和濕度、含5%CO2的常氧孵箱中培養;以37℃飽和濕度，含3%O2、5%CO2的條件模擬腫瘤細胞缺氧環境。

1.2 MTT法檢測GBC-SD增殖能力

分組：正常對照組（常氧組），缺氧組（模擬缺氧環境），吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組。取對數生長期的GBC-SD懸液，以0.8×104個/孔的密度接種于96孔板中培養，放于常氧和缺氧環境下各培養24 h，按照分組加入吳茱萸堿100 μg/mL，再繼續培養12、24、48、72、96 h;棄培養液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min;選擇490 nm波長測定各孔吸光值，實驗重復3次。

1.3 流式細胞術檢測GBC-SD的凋亡情況

采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術進行檢測。細胞分組同MTT法，取處于對數生長期的GBC-SD懸液，以密度為3.5×104個/孔接種到6孔板中，放于常氧和缺氧環境下各培養24 h，按分組加入吳茱萸堿100 μg/mL，再繼續培養24 h。收集各組細胞，PBS洗滌2次后加入Annexin V-PI，再加入FITC于室溫下孵育15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，實驗重復3次。

1.4 Western blot檢測VEGF、HIF-1α蛋白表達

實驗分組同MTT法，提取各組細胞的總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度檢測。分別制備濃縮膠和分離膠，加樣后進行蛋白電泳、轉膜，用含有5%脫脂牛奶封閉后，分別用一抗（稀釋倍數1∶1000）、二抗（稀釋倍數1∶1000）在室溫下孵育1 h，后在暗室內加超敏發光液孵育5 min，放于化學發光成像系統成像，采用Image J分析軟件進行圖像分析，實驗重復3次。

1.5 統計學方法

采用SPSS 23.0對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t多重檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞光密度值比較

三組GBC-SD光密度值在12 h時比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;與正常對照組比較，24、48、72、96 h缺氧組細胞光密度值均降低，差異均有統計學意義（均P < 0.05）;與缺氧組比較，吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組24、48、72、96 h的細胞光密度值均降低，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表1。

2.2 各組凋亡情況比較

三組GBC-SD的凋亡率分別：正常對照組為（6.97±0.36）%、缺氧組為（17.43±0.29）%、吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組為（26.60±0.23）%，與正常對照組比較，缺氧組GBC-SD凋亡率升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組GBC-SD凋亡率高于正常對照組和缺氧組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見圖1。

2.3 各組HIF-1α、VEGF蛋白表達水平比較

缺氧組GBC-SD的HIF-1α、VEGF蛋白的表達水平高于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。與正常對照組比較，吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組細胞內HIF-1α、VEGF蛋白表達水平降低，差異有統計意義（P < 0.05）;與缺氧組比較，吳茱萸堿（濃度100 μg/mL）+缺氧組細胞內HIF-1α、VEGF蛋白表達水平降低，差異有統計意義（P < 0.05），吳茱萸堿能明顯抑制GBC-SD內HIF-1α、VEGF蛋白表達。三組GBC-SD細胞的HIF-1α、VEGF蛋白表達帶及蛋白表達量。見圖2。

3 討論

缺氧是實體腫瘤生長過程中普遍存在的狀態，HIF-1α是腫瘤細胞在缺氧應答中的重要轉錄調節因子[6]。由于缺氧的程度和時間不同，HIF-1α在缺氧組織細胞凋亡中發揮了雙重作用。一方面，隨著腫瘤體積不斷增大，其生長的微環境中氧含量出現降低時，腫瘤細胞內HIF-1α蛋白的降解過程被抑制，導致其在腫瘤細胞內不斷積聚，進而刺激腫瘤細胞在缺氧狀態下血管生成，改善腫瘤生長微環境[7-8];另一方面，HIF-1α也能促進腫瘤細胞的凋亡，在缺氧狀態下，抑制凋亡蛋白數量減少，而促進凋亡蛋白Bax及前凋亡蛋白BNIP3表達水平均增高，并與HIF-1α表達水平呈正相關;此外野生型p53與HIF-1α的氧依賴ODD相互作用促進缺氧導致的細胞凋亡[9]。

VEGF是目前已知的作用最強、特異性最高的腫瘤血管生成促進因子，它也是HIF-1α的重要靶基因之一。VEGF能促進腫瘤細胞的增殖、抑制其凋亡，并且能夠誘導腫瘤細胞對放、化療產生耐受。研究發現，腫瘤細胞高表達的HIF-1α不僅可與VEGF 5′-末端增強子相互作用，促進VEGF基因表達上調;還可增加VEGF mRNA的穩定性，促進腫瘤細胞VEGF表達增加，從而調節腫瘤血管生成，增加腫瘤的供氧能力[10-11]。在腫瘤的血管生成和生長侵襲過程中VEGF和HIF-1α兩者起著相互協同的作用。多項研究提示，通過抑制HIF-1α的表達使VEGF的表達下調，可減少腫瘤組織的血管生成，抑制腫瘤組織在缺氧微環境下的糖酵解，從而抑制腫瘤生長[12-14]。

研究顯示，膽囊癌組織中的HIF-1α、VEGF均為高表達狀態，二者的表達量不僅與膽囊癌組織中的微血管計數呈正相關，也與患者的疾病進展成明顯正相關[15-16]。細胞凋亡實驗結果提示，缺氧微環境誘導膽囊癌細胞的凋亡，推測可能是由于缺氧時間較短，HIF-1α介導的促凋亡作用強于抗凋亡作用。蛋白檢測結果顯示，無論是在常氧環境還是在缺氧微環境下，GBC-SD內的HIF-1α和VEGF蛋白均有表達，但在缺氧的微環境下二者的表達要明顯增強。GBC-SD內的HIF-1α在缺氧微環境的刺激下表達上調，并誘導其下游靶基因VEGF的表達增強。

吳茱萸堿是中藥吳茱萸的有效成分，具有抗腫瘤作用[17]。大量實驗結果證實，吳茱萸堿能夠抑制腫瘤細胞的生長、促進其凋亡，并能抑制腫瘤細胞的侵襲轉移[18-20]。吳茱萸堿可通過抑制HIF-1α使VEGF的表達下調，導致過度增殖的腫瘤細胞無法適應缺氧微環境，達到抑制腫瘤增殖的效果[21]。此外，吳茱萸堿還可通過抑制缺氧狀態下腫瘤細胞HIF-1α的表達促進腫瘤細胞的凋亡[22-23]。本實驗結果顯示，在缺氧微環境下，吳茱萸堿能夠抑制GBC-SD的增殖，同時促進其凋亡。進一步的實驗結果提示，吳茱萸堿能夠明顯抑制GBC-SD的HIF-1α及VEGF蛋白的表達。由此，本研究認為在缺氧微環境下，通過抑制HIF-1α及其靶基因VEGF的表達可抑制GBC-SD增殖并促進其凋亡。因此，抑制腫瘤細胞HIF-1α及其靶基因VEGF的過表達，對于抑制腫瘤細胞的增殖、促進其凋亡有著十分重要的意義，這為抑制腫瘤生長帶來了新的思路。

綜上所述，吳茱萸堿能夠抑制缺氧微環境下GBC-SD的HIF-1α、VEGF蛋白的表達，使其無法適應缺氧微環境，從而抑制腫瘤細胞的生長，這為膽囊癌的治療提供了新方向。

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（收稿日期：2019-12-16? 本文編輯：封? ?華）