姜黃素類似物H8對糖尿病大鼠心臟的保護作用

仲崇琦，孫文慧，楊俊強，王猛，尚芮竹，張美樂，魏秀芳，袁曉環(huán)

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，影響糖尿病患者的生活質(zhì)量，使患者發(fā)生心力衰竭的風險大大增加，亦是引起患者死亡的重要原因之一［1］。由于糖尿病心肌病的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前對于糖尿病心肌病的治療手段主要是改進生活方式，控制血糖、血脂、血壓，改善微循環(huán)等［2］，但總體治療效果欠佳。姜黃素作為治療糖尿病的代表性中藥之一，具有改善胰島素抵抗［3-4］，改善糖尿病大鼠的心肌纖維化，減少抗糖尿病藥物對心臟產(chǎn)生的線粒體氧化應激［5］，抵抗炎癥反應［6］，減輕高糖誘導的心肌細胞凋亡［7］等作用。但由于其溶解性較低，組織分布受限，故生物利用度較低［8］，限制了其臨床應用。為此，本實驗室前期以姜黃素為母體設計合成了姜黃素類似物H8，提高了其生物利用度。本研究應用超聲心動圖檢測姜黃素類似物H8對糖尿病大鼠心肌結(jié)構(gòu)、功能的影響，探討其對心臟的保護作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級8周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，體質(zhì)量（180±20）g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。將大鼠置于牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心SPF 級動物房，適應性喂養(yǎng)1 周后用于實驗，飼養(yǎng)條件為：溫度（22±2）℃，濕度60%±5%，12 h 交替照明，自由進食飲水。實驗操作經(jīng)牡丹江醫(yī)學院動物保護與使用委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 H8（淡黃色粉末，純度99.6%），由牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心設計合成［9-10］。高脂高糖飼料（每60 kg 含大鼠維持飼料44.22 kg、豬油9 kg、蛋黃粉6 kg、膽固醇0.72 kg、膽酸鈉0.03 kg、丙硫氧嘧啶0.03 kg），由小黍有泰（北京）生物科技有限公司加工制備，SPF級大鼠維持飼料由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司加工制備。鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）、伊紅、蘇木素染色液購自北京索萊寶科技有限公司，羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。全自動生化分析儀（AU5800，美國Beckman Coulter 公司），小動物超聲成像系統(tǒng)（VEVO770，加拿大VisualSonics 公司），酶標儀（M3，美國Molecular Devices 公司），紫外可見分光光度計（TU-1901，北京普析通用儀器有限責任公司），包埋機（EG1160）、旋轉(zhuǎn)式切片機（M18170E，德國Leica 公司），生物顯微鏡（IX70，德國Leica 公司），超微量蛋白核酸測定儀（NanoDrop 2000，美國Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型制備 24只雄性SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和H8 組，每組8 只。對照組以SFP級大鼠維持飼料喂養(yǎng)，模型組和H8組以高脂高糖飼料喂養(yǎng)。8周后，模型組和H8組隔日腹腔注射檸檬酸緩沖液溶解的STZ（10 g/L），劑量為25 mg/kg，注射3次；對照組腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖液。給藥72 h后測定大鼠空腹血糖，連續(xù)3 d空腹血糖＞11.1 mmol/L提示2型糖尿病模型建立成功。造模成功后H8組大鼠以6 mg/kg的H8（用1%CMC-Na溶解）灌胃，每日1 次，連續(xù)4 周；對照組和模型組每日以等量1%CMC-Na 溶液連續(xù)灌胃4 周。分別于注射STZ 前和注射2、4周后測量大鼠體質(zhì)量。灌胃第4周末，進行超聲心動、血液生化及心肌組織學等檢測。

1.3.2 超聲心動圖檢測 各組大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉，褪去胸毛后平置于操作臺上，取仰臥位，采用超聲心臟探頭，探頭頻率為13 MHz，行M型超聲技術(shù)采集大鼠舒張期左心室前壁厚度（LVAWd）、舒張期左心室后壁厚度（LVPWd）、舒張期左心室內(nèi)徑（LVIDd）、收縮期左心室內(nèi)徑（LVIDs）、左室射血分數(shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）。以大鼠左心室前壁和后壁的收縮期室壁增厚率（WT）評價大鼠左心室室壁運動情況，WT=（收縮期室壁厚度-舒張期室壁厚度）/舒張期室壁厚度×100%。

1.3.3 血液生化指標測定 將各組大鼠禁食不禁水12 h，眼眥靜脈取血1 mL，5 000×g，離心10 min，取血清后使用全自動生化分析儀檢測血糖（GLU）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平。

1.3.4 心肌組織病理學染色 各組大鼠麻醉后取出心臟，仔細剪去多余的血管、脂肪，用預冷的生理鹽水沖洗殘余血液，剪取左心室心肌組織置于含有4%多聚甲醛的EP管中，固定48 h，常規(guī)乙醇梯度脫水，包埋機包埋，切片，厚度為4 μm，蘇木素-伊紅法（HE）染色，中性樹膠封片，在200倍和400倍光鏡下，觀察各組大鼠心肌組織的形態(tài)變化。

1.3.5 心肌組織LDH活性測定 采用微量酶標法，切取小塊左心室組織放入EP管中，加入生理鹽水后用研磨棒研磨，制成0.05%的心肌組織勻漿，使用NanoDrop 2000 測定其蛋白濃度，按照LDH 試劑盒說明書進行操作，酶標儀于波長450 nm處測定光密度（OD）值，組織中LDH活性（U/g prot）=（測定OD 值-對照OD 值）/（標準OD 值-空白OD 值）×標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度。

1.3.6 心肌組織T-SOD和MDA含量測定 均采用紫外分光光度法，切取小塊左心室組織放入EP管中，加入生理鹽水后用研磨棒研磨，制成5%的心肌組織勻漿，使用NanoDrop 2000 測定其蛋白濃度，嚴格按照T-SOD 和MDA 試劑盒說明書進行操作，分別于波長550 nm 和532 nm 處，1 cm 光徑，使用紫外分光光度計測定各組光密度（OD）值。T-SOD 活力（U/mg prot）=（對照OD 值-測定OD 值）/對照OD 值÷50% ×（反應液總體積/取樣量）÷待測樣本蛋白含量。MDA 含量（μmol/g prot）=（測定OD 值-對照OD 值）/（標準OD 值-空白OD值）×標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度（g prot/L）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析和重復測量設計的方差分析，組間多重比較行LSD-t法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 對照組大鼠毛色光亮，進食、飲水、排尿、排便正常，精神狀態(tài)佳，反應靈敏；模型組大鼠注射STZ后毛色光澤度明顯減弱，有明顯的“三多一少”表現(xiàn)，精神逐漸萎靡，其中1只出現(xiàn)糖尿病性白內(nèi)障，1只在實驗過程中死亡；與模型組相比，H8組上述表現(xiàn)均有不同程度改善，無死亡。對照組大鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長，模型組和H8組在注射STZ 后體質(zhì)量逐漸下降，各組大鼠注射STZ 前后體質(zhì)量變化情況見表1。

Tab.1 Comparison of body weights of rats before and after STZ injection between three groups表1 各組大鼠注射STZ前后體質(zhì)量比較 （g）

Tab.1 Comparison of body weights of rats before and after STZ injection between three groups表1 各組大鼠注射STZ前后體質(zhì)量比較 （g）

F組間=2.668，P＜0.05；F時間=41.720，P＜0.05；F交互=0.340，P＞0.05；組間比較：a與對照組相比，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與注射STZ前比較，B與注射STZ 2周比較，P＜0.05

2.2 各組大鼠左心室結(jié)構(gòu)比較 與對照組相比，模型組大鼠LVPWd、LVEF和FS降低，LVIDs增大（P＜0.05）；與模型組相比，H8組大鼠LVPWd、LVEF和FS增高，LVIDs 減小（P＜0.05）；3 組大鼠LVAWd 和LVIDd差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

2.3 各組大鼠左心室室壁運動情況比較 與對照組相比，模型組大鼠左心室前壁和后壁WT 降低（P＜0.05）；與模型組相比，H8組大鼠左心室前壁和后壁WT升高（P＜0.05），見表3。

2.4 各組大鼠生化指標比較 與對照組相比，模型組大鼠血清中GLU、TC、TG 水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，H8 組大鼠血清中GLU、TC、TG 水平降低（P＜0.05），見表4。

Tab.2 Comparison of left ventricular structure and function between three groups表2 各組大鼠左心室結(jié)構(gòu)及功能比較 （）

Tab.2 Comparison of left ventricular structure and function between three groups表2 各組大鼠左心室結(jié)構(gòu)及功能比較 （）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

Tab.3 Comparison of left ventricular wall thickening between three groups表3 各組大鼠左心心室WT比較（%）

Tab.3 Comparison of left ventricular wall thickening between three groups表3 各組大鼠左心心室WT比較（%）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

Tab.4 Comparison of biochemical indicators of rats between three groups表4 各組大鼠生化指標比較 （）

Tab.4 Comparison of biochemical indicators of rats between three groups表4 各組大鼠生化指標比較 （）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組H8組F n8 7 8 GLU（mmol/L）5.08±0.13 18.94±2.24a 9.70±0.88b 28.010＊TC（mmol/L）1.23±0.22 2.12±0.12a 1.26±0.22b 6.753＊TG（mmol/L）0.50±0.08 1.21±0.24a 0.49±0.09b 6.849＊

2.5 各組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果比較 HE 染色顯示，對照組大鼠心肌結(jié)構(gòu)正常，心肌細胞排列整齊，肌纖維連續(xù)，線粒體在肌纖維之間有序分布；與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，心肌組織出現(xiàn)斷裂，鏡下可見不規(guī)則的肌原纖維，線粒體在其間錯亂分布；與模型組相比，H8 組大鼠心肌細胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)紊亂情況明顯好轉(zhuǎn)，見圖1。

2.6 各組大鼠心肌組織LDH、T-SOD 和MDA 水平比較 與對照組相比，模型組大鼠心肌組織中LDH、MDA 水平明顯升高，T-SOD 水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，LDH、MDA 水平明顯降低，TSOD水平明顯升高（P＜0.05），見表5。

3 討論

Fig.1 Histopathological changes of myocardium in each group（HE staining）圖1 各組大鼠左心室心肌組織病理學變化（HE染色）

Tab.5 Comparison of LDH,T-SOD and MDA in myocardial tissues between three groups表5 各組大鼠心肌組織LDH、T-SOD和MDA含量比較

糖尿病心肌病是指發(fā)生于糖尿病患者，不能用高血壓性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及其他心臟病變來解釋的心肌疾病，是糖尿病患者致殘和致死的主要原因之一［11］。糖尿病心肌病常伴有局部炎癥、氧化應激、心肌纖維化和心肌細胞凋亡等，這些變化可引起心肌收縮功能障礙、左心室肥大和擴張型心肌病，進而影響心輸出量，最終導致心力衰竭［12-13］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠左心室室壁運動減弱、心室重構(gòu)明顯、心功能降低，GLU、TC、TG水平明顯升高，心肌細胞結(jié)構(gòu)紊亂，心肌組織中LDH、MDA水平明顯增加，T-SOD水平明顯降低，符合糖尿病心肌病的病理生理改變。給予糖尿病大鼠黃素類似物H8 治療后，其左心室室壁運動情況、心室重構(gòu)情況及心功能均較模型組明顯改善，提示姜黃素類似物H8 對糖尿病大鼠心肌損傷具有保護作用。

血脂異常是增加糖尿病患者動脈粥樣硬化性心臟病易感性的危險因素之一。 Panahi 等［14］研究結(jié)果顯示，給予2型糖尿病患者1 g/d姜黃素12周干預后，其血清血脂水平明顯降低。另有研究表明，姜黃素類似物H8 作為11β-羥基類固醇脫氫酶1 型（11βHSD1）抑制劑不但可通過抑制糖異生降低糖尿病小鼠的血糖濃度［9］，亦可通過抑制糖皮質(zhì)激素過表達，減少db/db小鼠內(nèi)臟脂肪，改善脂代謝紊亂［15］，從而達到降糖、降脂的作用。本研究結(jié)果顯示，H8組大鼠血清中GLU、TC、TG水平較模型組明顯降低，提示姜黃素類似物H8 可能通過改善糖尿病大鼠血糖、血脂異常來發(fā)揮其對心肌損傷的保護作用。

氧化應激參與了糖尿病及糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展。有研究顯示，氧化應激可使β 細胞功能惡化，是2型糖尿病發(fā)病機制之一，造成糖尿病患者的糖毒性和脂毒性；此外，晚期糖基化終產(chǎn)物可通過氧化應激誘導內(nèi)皮功能障礙，并導致2 型糖尿病患者微血管和大血管并發(fā)癥的發(fā)生［16-17］。LDH、SOD 和MDA是氧化應激的標志物。Ye等［18］研究表明，SOD水平升高可部分修復糖尿病小鼠的線粒體功能紊亂和心肌細胞的收縮功能。目前已有多項研究證實姜黃素具有抗氧化作用［19-21］。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，H8組大鼠經(jīng)姜黃素類似物H8治療后，其SOD 活性明顯增加，MDA 及LDH 水平明顯降低；提示姜黃素類似物H8 可能通過改善糖尿病大鼠心肌氧化應激損傷來發(fā)揮其對心肌損傷的保護作用。

綜上所述，姜黃素類似物H8對糖尿病大鼠心臟具有保護作用，其作用機制一方面可能與降低血糖、血脂及改善心室重構(gòu)和心功能有關，另一方面可能與改善心肌氧化應激損傷有關，即可能通過影響SOD、MDA和LDH活性而發(fā)揮作用。