馬錢子水煎液對骨轉移小鼠疼痛及骨轉移灶中破骨細胞的影響

喬翠霞，張新峰，程旭鋒，劉 琦，蔡小平*

（1.河南省中醫藥研究院，河南鄭州 450004； 2.鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南鄭州 450008； 3.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南鄭州 450000； 4.河南中醫藥大學，河南鄭州 450046）

據臨床統計，中晚期惡性腫瘤患者發生骨轉移高達70%左右，其中較為多見的腫瘤有晚期乳腺癌 （70%～80%）、中晚期前列腺癌 （70%～80%） 和晚期肺癌（10%～50%） 等［1-2］。腫瘤引起的骨轉移，往往會破壞骨質，引發嚴重的骨不良事件，如難以忍受的骨痛、無誘因的發生病理性骨折、甚至脊髓壓迫等，均會嚴重影響其生存質量，并給患者帶來精神及肉體上的極大創傷，大大加重腫瘤患者的經濟負擔及口服止痛藥物帶來的副作用［3］。在我國，目前西醫臨床上針對惡性腫瘤發生明確的骨轉移后定期行雙磷酸鹽治療，合并局部微創手術、骨轉移灶放療、化療等多種手段必要時采用配合治療［4］。隨著近年來，中醫藥在腫瘤探索治療中的參與，中晚期腫瘤患者在發生骨轉移后在選擇西醫療法的同時，常伴隨中醫藥辯證治療貫穿始終，往往能一定程度的提高臨床治療骨轉移的療效。馬錢子在中國古籍中記載具有鎮痛作用，可用于骨關節疼痛疾病治療［5-6］，有藥理研究表明其活性成分具有抗腫瘤、促進骨損傷修復等作用［7-9］。本實驗初步探討馬錢子治療乳腺癌骨轉移癌痛及骨質損傷的機制。

1 材料

1.1 動物及細胞株 SPF 級雌性BALB ／c 小鼠共32 只，4周齡，體質量（18±2） g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK （滬） 2013-0016。人乳腺癌骨高轉移細胞MDA-MB-231BO，美國德克薩斯州立大學醫學系Toshiyuki Yoneda 博士惠贈。

1.2 藥物 稱取馬錢子3.9 g，首先加入雙蒸水750 mL，藥物充分浸泡2 h，武火煮沸30 min，將藥液過濾，得第1次濾液；然后將藥渣再加雙蒸水500 mL，進行武火煮沸30 min，再次將藥液過濾，得第2 次濾液；最后將2 次藥物的濾液合并在一起，采用80 ℃恒溫水浴，濃縮至500 mL，最終制成7.8 mg 生藥／mL，進行滅菌后，將制備好的馬錢子藥液放置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 試劑 戊巴比妥鈉（批號p3761） 購自美國Sigma 公司；唑來膦酸注射液（4 mg／支，批號H20041346） 購自江蘇省正大天晴藥業集團股份有限公司；注射器 （批號1306230） 購自美國BD 公司；75% 乙醇（批號20160130）購自鄭州吉爾康消毒制品有限公司。

1.4 儀器 醫學圖像采集系統購自日本奧林巴斯株式會社；倒置顯微鏡購自日本Nikon 株式會社；Von Frey 細纖維購自美國North Coast Medical 公司；BME-410C 自動熱痛刺激儀購自天津伯爾尼科技有限公司；十萬分之一電子天平購自瑞士Mettler-Toledo 公司。

2 方法

2.1 造模及給藥 乳腺癌小鼠骨轉移癌痛模型的建立參考文獻［10］方法，采用0.4% 戊巴比妥鈉將各組小鼠麻醉后，仰臥，75%乙醇對左后肢皮膚進行消毒，在脛骨上部切一長約0.5 cm 的切口，充分暴露左脛骨內側面，在膝關節下方約5 mm 處沿脛骨長軸，然后用23G 一次性無菌注射器針頭進行打孔，針頭進入骨髓腔，然后換上30 μL注射器進入股骨骨髓腔，下一步緩慢注入20 μL 乳腺癌骨高轉移細胞MDA-MB-231BO 細胞（1.0×107／mL），注射完畢后用骨蠟封堵針孔，然后將肌肉和皮膚逐層縫合。假手術組采用同樣的方法在脛骨注入等體積的生理鹽水。將小鼠隨機分成假手術組、模型組、馬錢子組、唑來膦酸組，每組8 只。各組于術后第4 天開始給藥［11］，假手術組、模型組和唑來膦酸組均給予0.2 mL 雙蒸水灌胃，馬錢子組給予78 mg／kg 馬錢子煎液灌胃，1 次／d，連續4 周；唑來膦酸組腹腔注射唑來膦酸0.2 mg／kg［12］，假手術組、模型組和馬錢子組均進行腹腔注射生理鹽水0.5 mL，連續4 周，3次／周。

2.2 各組小鼠機械性痛覺超敏檢測 采用小鼠機械性痛覺超敏法［13］。在治療前后分別用2 g Von Frey 纖維刺激各組小鼠左后足底部，5～6 s 后觀察各組小鼠縮足反應，記錄縮足次數。每只小鼠進行實驗5 次，每2 次實驗必須間隔3 min。縮足反應率＝ ［（縮足次數／5）］×100%。

2.3 各組小鼠熱刺激痛覺過敏檢測 分別于治療前后評估小鼠熱刺激痛覺過敏［13］情況。將調節熱板儀溫度設置為（50±1）℃，然后將各組小鼠分別放置于熱板上，觀察各組小鼠的反應，立即計時至小鼠開始舔左后足時的時間，每次間隔15 min，每只測3 次，其均值為該小鼠的熱刺激痛閾值。

2.4 各組小鼠Micro-CT 檢測 按照前期報道［12］進行。各組小鼠采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，分別取出左后脛骨，沿脛骨長軸方向掃描脛骨近端，采用Micro-CT 掃描，掃描角度360 °、分辨率10 μm，獲取醫學顯微CT （μ-CT）圖像；在主機上選取生長板下1 mm 和脛骨近端1.5 mm 的區域為敏感區域（ROI），進行三維圖像重建，最后采用機載軟件分析骨礦物質密度（BMD）、骨體積（BV）、選取感興趣區域（ROI） 體積（TV），計算相對骨體積或骨體積分數BV／TV。

2.5 各組骨轉移灶TRAP 染色觀察 按照前期報道［11-12］進行。取各組小鼠骨轉移灶組織，采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，行病理切片，TRAP 染色，觀察破骨細胞形態，并記錄TRAP 陽性細胞數量。

2.6 統計學分析 采用SPSS 17.0 統計軟件，計量資料以（） 表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠縮足反應百分率比較 與假手術組比較，模型組治療前、后小鼠縮足反應百分率均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，唑來膦酸組、馬錢子組治療后小鼠縮足反應百分率均降低（P＜0.05，P＜0.01），而其治療前差異無統計學意義（P＞0.05）；與治療前比較，模型組治療后小鼠縮足反應百分率升高（P＜0.01），唑來膦酸組、馬錢子組治療后小鼠縮足反應百分率均降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠縮足反應百分率比較（， n＝8）

表1 各組小鼠縮足反應百分率比較（， n＝8）

注：與假手術組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與治療前比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.2 各組小鼠熱刺激痛閾值比較 與假手術組比較，模型組治療前、后小鼠熱刺激痛閾值均降低（P＜0.01）；與模型組比較，唑來膦酸組、馬錢子組治療后小鼠熱刺激痛閾值均升高（P＜0.01）；與治療前比較，唑來膦酸組、馬錢子組治療后均升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠熱刺激痛閾值比較（， n＝8）

表2 各組小鼠熱刺激痛閾值比較（， n＝8）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與治療前比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.3 各組小鼠左后脛骨轉移灶骨質破壞情況 Micro-CT 掃描發現，假手術組小鼠無明顯骨質破壞；其余各組均存在一定程度的骨質破壞，BV／TV 值降低，BMD 下降；與假手術組比較，模型組骨質破壞嚴重，BMD、BV／TV 值均下降（P＜0.01）；與模型組比較，唑來膦酸組、馬錢子組小鼠骨質破壞均有所減輕，BMD 和BV／TV 值均升高（P＜0.01）。見圖1、表3。

圖1 各組小鼠左脛骨三維Micro-CT 掃描圖

表3 各組小鼠BMD、BV／TV 比較（， n＝8）

表3 各組小鼠BMD、BV／TV 比較（， n＝8）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

3.4 各組小鼠骨轉移灶中TRAP （＋） 細胞數量比較 與假手術組比較，模型組TRAP （＋） 細胞數量增加 （P＜0.01）；與模型組比較，唑來膦酸組、馬錢子組TRAP （＋）細胞數量均減少（P＜0.01），見表4。

表4 各組小鼠骨轉移灶中TRAP （＋） 細胞數量（，n＝8）

表4 各組小鼠骨轉移灶中TRAP （＋） 細胞數量（，n＝8）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

4 討論

中醫古籍里并無關于的腫瘤骨轉移病名記載，但就其癥狀可散見于中醫“脛陰疽”“骨蝕”“肉瘤”“石榴疽”“骨瘤”“骨痹”等范疇。早在《五十二病方》 已有骨睢（疽） 的記載。《素問·長刺節論》：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至名曰骨痹”，《華佗神醫秘傳》 記載骨質腫瘤的臨床表現，“腫不變色，漫腫疼痛，堅硬如石”，《醫宗金鑒》：“骨痹，則骨重酸疼不能舉也”，均是對骨轉移腫瘤特點的描述。本課題組認為骨轉移日久可出現疼痛，成因與發展，主要在于陽虛、痰凝兩個方面。其病機不外乎“不通則痛”“不榮則痛”。多為正氣虧虛，癌毒內生所致。“癌毒”多為痰凝日久凝聚于骨的結果。痰濁隨氣升降，流注臟腑經絡，運動周身，無處不到，外而皮肉筋骨，痰濁與癌毒互結而成痰毒，痰毒流注于骨而形成骨轉移瘤，使經絡壅塞不通、痰阻血瘀，從而引起機體疼痛；而痰瘀癌毒互結，耗傷正氣，皆可導致頑固、持久之癌痛。

正如《證治要訣》 云：“痛則不通，通則不痛”，腫瘤骨轉移患者往往因為痰濁流注血脈、經絡，阻礙氣血津液的運行受阻而產生骨骼疼痛。

中藥馬錢子具有舒筋活血、散寒通絡、化痰散結、止痛的功效，針對痰毒流注病機，可多種原因導致的骨關節疾病的治療［5-6，14-15］。清代王維德在《外科全生集》 中謂馬錢子能“搜筋骨入骱之風濕，祛皮里膜外凝結之痰毒”。張錫純在《醫學衷中參西錄》 中指出馬錢子具有“開通經絡，透達關節之力，遠勝它藥”。現代藥理研究也證實馬錢子可用于多種惡性腫瘤及疼痛的防治［7-8，16-17］。

機械性痛覺超敏、熱刺激痛覺過敏是目前評價生理性疼痛程度的主要評價指標。本實驗結果顯示，與模型組治療后及本組治療前比較，馬錢子組治療后小鼠縮足反應百分率均明顯升高，而熱刺激痛閾值均明顯降低，提示馬錢子能抑制乳腺癌骨轉移小鼠觸誘發痛和熱刺激痛覺過敏，說明馬錢子具有緩解骨轉移癌痛的作用。進一步通過micro-CT 對各組小鼠的骨轉移灶進行掃描提示，模型組小鼠骨轉移灶的BV／TV 值偏低，BMD 下降，提示骨轉移灶中存在一定程度的骨質流失，該結果與前期報道一致［11，13］，馬錢子可使小鼠骨轉移組織BV／TV 值及BMD 升高，提示其對骨轉移灶的骨質流失具有一定的抑制作用。骨代謝依賴于破骨細胞介導骨吸收和成骨細胞介導骨形成的動態平衡，破骨細胞活性的相對增加可導致骨質流失。TRAP 是破骨細胞的特征性酶，本實驗中模型組骨轉移灶中TRAP （＋） 細胞明顯增多，提示骨轉移發生后破骨細胞過度激活，該結果與前期報道一致［11，13］，馬錢子組TRAP （＋） 細胞數量較模型組均明顯減少，提示馬錢子對破骨細胞具有一定的抑制作用。

綜上所述，馬錢子可以緩解骨轉移小鼠癌痛，其機理可能與其能抑制骨轉移灶中破骨細胞的活性，減少骨質流失有關。