一株耐鹽真眼點藻（Eustigmatos sp.）的戶外培養及油脂提取工藝研究

李濤 趙偉 楊冰潔 陳子碩 吳華蓮 吳后波 向文洲

（1. 中國科學院南海海洋研究所 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室 廣東省海洋藥物重點實驗室 廣州 510301；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（廣州），廣州 510301）

微藻油具有制備生物柴油的潛力，受到國內外政府和科學家的廣泛關注［1］，微藻油除了可以作為生物柴油的生產原料外，其特殊的脂肪酸組成也賦予它在抗氧化、損傷修復及提高免疫力等方面的活性［2］。

真眼點藻（Eustigmatos）具有生長速率快、可以積累高含量微藻油和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）等特性，是一種極具開發潛力的微藻資源［3］。魏氏真眼點藻（Eustigmatosvischeri）的生物質濃度可以達到9.14 g/L、總脂含量達到60.8% DW（Dry weight），波氏真眼點藻（Eustigmatospolyphem）的生物質濃度甚至可以達到11.0 g/L、總脂含量超過50% DW，目前對于真眼點藻的研究主要集中在氮、磷對其生長和油脂積累的影響（室內）［4-5］，戶外培養與室內培養存在較大差異，如溫度、光照、微生物等都難以控制，室內數據可能與戶外數據存在較大的偏差［6］。用于微藻培養的光生物反應器有多種類型，包括柱式、管式和平板式等［7］，其中，平板式光生物反應器具有比表面積大、光線穿透性率高、加工方便等優點［8］，被廣泛用于微藻養殖中，Gao等［9］利用室內平板式光生物反應器培養波氏真眼點藻（Eustigmatoscf.polyphem），獲得了0.142 g/L·d的生物質產率，可見平板式光生物反應器適于真眼點藻的培養，戶外培養條件下是否也可以獲得同樣的生物質產率，未見相關報道。

微藻油脂屬于細胞內油脂，需要采用合適的方法將其提取出來，常用的提取方法包括正己烷/乙醇、氯仿/甲醇等體系［10］，如氯仿/甲醇體系需要在50℃的條件下攪拌數小時，才可以獲得較高的提取效率［11］，作為食品用途的油脂，上述溶劑存在潛在的致毒害風險［12］。因此，尋找一種更加安全無污染的提取溶劑至關重要。乙醇具有親水性和親脂性雙重特性，細胞穿透性強，是一種常用的有機提取溶劑［13］，也有用乙醇進行微藻油脂提取的報道［14］，如果可以利用乙醇提取真眼點藻油脂，將大幅降低真眼點藻油脂的提取成本。

本研究利用自行設計的一套平板式光生物反應器，評價一株耐鹽真眼點藻（Eustigmatossp.SCSIO-45821）的戶外生產性能，同時研究乙醇提取真眼點藻油脂的可行性，研究結果為真眼點藻油的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種及培養方法 真眼點藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）分離自寧夏固原市羅洼鄉（N36°15'28.23″，E106°35'12.76″），現保藏于中國科學院南海海洋研究所海藻資源與生物技術實驗室。

利用氮元素減量的BG-11培養基作為真眼點藻戶外培養的培養基，培養基含有以下成分為:NaNO3（0.5 g/L），K2HPO4·3H2O（40 mg/L），NaHCO3（2.0 g/L），MgSO4·7H2O（75 mg/L），CaCl2·2H2O（36 mg/L），FeCl3·6H2O（3.15 mg/L），Citric acid（6.0 mg/L），EDTANa2·2H2O（4.36 mg/L），H3BO3（2.86 mg/L），MnCl2·4H2O（1.18 mg/L），ZnSO4·7H2O（0.22 mg/L），Na2MoO4·2H2O（0.39 mg/L），Co（NO3）2·6H2O（0.05 mg/L）和 CuSO4·5H2O（0.08 mg/L）。

1.1.2 平板式光生物反應器設計 平板光生物反應器利用普通白玻璃（厚度1.0 cm）與硅膠加工而成，不銹鋼外框加固反應器，兩種規格包括:（1）光徑4 cm:高度120 cm（裝液高度100 cm），長度120 cm，有效體積為48 L；（2）光徑6 cm:高度120 cm（裝液高度100 cm），長度120 cm，有效體積為72 L。

采用反應器外表面噴淋的方式降溫，藻液溫度保持在28℃（環境溫度為33-35℃）。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計

1.2.1.1 戶外培養實驗 選擇廣州非雨季進行戶外評價實驗，培養時間為10 d，藻細胞經室內擴種后，直接接入戶外4 cm和6 cm平板式光生物反應器中，初始接種OD750為0.5，連續鼓入二氧化碳加富的壓縮空氣提供碳源和攪拌（1% CO2），培養周期內，白天平均溫度在33.4 ± 1.2℃，平均光照強度1 000 ±280 μmol photons/m2s，每2 d測定生物質濃度，離心收集藻細胞，凍干后測定總脂含量和脂肪酸組成，每天鏡檢觀察雜藻和原生動物情況。

1.2.1.2 乙醇提油實驗 （1）不同提取時間對油脂提取率的影響:常溫條件下，利用100%乙醇進行攪拌抽提，0.5、1、2、3、4、5、6、12、18、24 和36 h取樣，利用氮吹儀將乙醇吹干后，利用重量法計算油脂提取率；（2）不同乙醇濃度對油脂提取率的影響:設置乙醇濃度為60%、70%、80%、95%和100%，常溫條件下，提取時間為8 h，油脂提取率按（1）計算；（3）不同提取溫度對油脂提取率的影響:設置提取溫度為20、30、40、50、60和70℃，提取時間8 h，乙醇濃度為100%，油脂提取率下述公式計算。

油脂提取率（%）= m2/（m1× 32.5%）×100%其中，32.5% DW為本研究所用藻粉的總脂含量（采取改良的Khozin-Goldberg法測定），乙醇提取的油脂重量用m2表示，藻粉重量用m1表示。

油脂品質檢測:將乙醇提取得到的油脂進行品質檢測，利用硅膠柱層析法測定不同脂類組分的比例，利用氣相色譜法測定油脂的脂肪酸組成。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 形體觀察 利用光學顯微鏡（Olympus CX41，Olympus Corporation，Japan），觀察藻細胞形態特征。

1.2.2.2 分子鑒定及進化樹的構建 利用CTAB法提取DNA，利用18S rRNA的引物對基因進行擴增（正向引物:5'-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3'，反向引 物 :5'-CACCTACGCAAACCTTGTTACGACTT-3'），PCR產物測序后進行序列比對，采用Clustal X 1.8和MEGA7.0軟件構建系統進化樹。

1.2.2.3 生物質濃度和生物量的測定 取10 mL的藻液，用預先80℃烘干至恒重的混合纖維濾膜（0.45 μm）進行抽濾，再將有藻細胞的濾膜放置在80℃烘箱烘至恒重，用減差法得到生物質濃度。

生物量（g）= 生物質濃度（g/L）× 培養體積（L）

1.2.2.4 總脂含量的測定和分級 采取改良的Khozin-Goldberg法測定藻粉中總脂含量［15］。

以一定體積的氯仿-甲醇（1∶1，V∶V）溶解總脂，利用硅膠層析柱（500 mg Sep-PakTMcartridge of silicagel，Waters）進行總脂分級。上樣后，依次利用氯仿、丙酮和甲醇洗脫獲得中性脂（主要為TAG），粗糖脂（GLs）和磷脂（PLs），每一組用氮氣吹干至恒重，得到不同脂類組分的重量［15］。

1.2.2.5 脂肪酸相對含量的測定 參照李濤等［15］的方法，凍干藻粉（或藻油10 mg）在H2SO4的催化作用下，生成脂肪酸甲酯，隨后利用氣相色譜測定脂肪酸相對含量，利用37種標準樣品對脂肪酸種類進行鑒定。

1.2.2.6 產率的計算

單位體積生物質產率（g/L·d）=（m2-m1）/Δt

單位面積生物質產率（g/m2·d）=（m2-m1）× h/Δt其中:m2為t2時間的生物質濃度（g/L），m1為t1時間的生物質濃度（g/L），Δt為培養時間（t2-t1），h為反應器的藻液高度（m）。

1.2.3 統計分析 本論文中所有圖表所示的平均值和標準偏差均由2個生物學重復和3個測定重復計算獲得；利用SPSS 18.0進行數據分析（ANOVA）；采用S-N-K方法對不同處理組進行多重比較；樣品均值之間的差異用最小顯著性差異（LSD）進行分析，置信度為0.05。

2 結果

2.1 藻種形態及分子進化樹

圖1-A-D為 真 眼 點 藻（Eustigmatossp.SCSIO-45821）的形態特征，該藻為單細胞球形，直徑為8-12 μm，細胞內存在多個震動顆粒，細胞內液泡，存在紅色或橙色異質區域，葉綠體呈裂葉狀周生，細胞以產生2個D型或4個正四面體的似親孢子進行繁殖，上述形態特征特征與波氏真眼點藻（Eustigmatos polyphem）特征相符。根據真眼點藻SCSIO-45821的細胞形態（圖1）和系統進化樹［16］，推測真眼點藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）屬于真眼點藻（Eustigmatophyceae）、真眼點藻目（Eustigmatales）、真眼點藻科（Eustigmataceae）、真眼 點 藻 屬（Eustigmatos）， 因 此，Eustigmatossp.SCSIO-45821可能為波氏真眼點藻（E.polyphem）。

圖1 真眼點藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）的形態特征

2.2 戶外生長情況

真眼點藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）在不同光徑平板反應器中的生長曲線如圖2所示，培養第0-4天，4 cm光徑反應器中真眼點藻的生長速率快于6 cm光徑反應器，而4 d后，6 cm光徑反應器的生長速率快于4 cm光徑反應器，至培養結束（第10天），6 cm光徑反應器的生物質濃度達到1.1 g/L，較4 cm 光徑反應器（1.0 g/L）增加了10.0%。培養體積乘以生物質濃度等于生物量，計算得到6 cm光徑反應器的生物量為76.3 g，而4 cm光徑反應器僅有46.3 g，6 cm光徑反應器比4 cm光徑反應器增加了64.8%（P＜0.01），由此可見，6 cm光徑反應器更加適合真眼點藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）生物質的積累，鏡檢觀察確認整個培養過程中兩種反應器均未出現雜藻和原生動物污染，保證了結果的可信性。

培養結束時（第10天），兩種光徑反應器中藻液的顏色如圖3所示:6 cm光徑反應器藻液顏色為綠色，而4 cm光徑反應器中藻液顏色變為黃綠色，上述現象說明:4 cm光徑反應器中藻細胞色素的組成和含量可能與6 cm光徑反應器存在差異。

2.3 脂類積累及脂肪酸變化規律

圖2 真眼點藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）在不同光徑平板光生物反應器的生長情況

圖3 培養結束時真眼點藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）在不同反應器中顏色變化

培養0-6 d，隨著培養時間的延長，兩種光徑反應器的總脂含量均呈現增加趨勢，4 cm光徑反應器的油脂積累速率快于6 cm光徑反應器，它們均在第6天達到最大值，4 cm光徑反應器培養條件下，真眼點藻SCSIO-45821的總脂含量為30.1% DW，較6 cm光徑反應器增加32.0%（P＜0.01），6 d后，兩種光徑反應器的總脂含量均呈現降低趨勢，至培養第10天，6 cm光徑反應器降至15.6% DW，4 cm光徑反應器降至25.8% DW（圖4）。

圖4 真眼點藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）總脂含量的變化規律

真眼點藻（Eustigmatossp.）的主要脂肪酸包括 C14:0、C16:0、C16:1、C18:1、C18:2、C20:4和C20:5（EPA），其中，C16:1的相對比例高于其他脂肪酸，隨著培養時間，C16:1呈增加趨勢，4 cm光徑反應器培養條件下，真眼點藻SCSIO-45821最高C16:1含量為57.6% TFA（Total fatty acid），6.0 cm光徑反應器培養條件下，最高為56.4% TFA；然而C20:5（EPA）在第4天達到最高值，4 cm光徑反應器為8.2% TFA，6 cm 光徑反應器為8.9% TFA，隨后開始降低，4 cm光徑反應器EPA含量的降低幅度高于6.0 cm光生物反應器，培養結束（第10天），4 cm光徑反應器僅有2.2% TFA，而6 cm光徑反應器為4.0% TFA，兩者相比存在顯著性差異（P＜0.01）（圖 5）。

2.4 乙醇油脂提取工藝

為了評估利用乙醇提取真眼點藻油的可行性，本論文開展了單因素對油脂提取率影響的研究，包括提取溫度、乙醇濃度及提取時間（圖6），結果表明:提取溫度對油脂提取率影響較小，提取溫度在20-60℃范圍內，提取率保持在49.5%，當提取溫度為70℃度時，提取率反而降低，為40.0%。乙醇濃度對提取率的影響較大，隨著乙醇濃度的提高，油脂提取率增加，100%乙醇濃度時，油脂提取率最大，為48.8%。提取時間明顯影響油脂提取率，隨提取時間的延長（0.5-48 h），總脂提取率逐漸增加，當提取時間為36 h時，提取率達到94.3%，繼續增加提取時間，總脂提取率不再增加。上述結果表明:乙醇可以用于真眼點藻油脂的提取，理想的提取條件為常溫條件下，乙醇濃度100%，提取時間36 h。

真眼點藻粗油脂類的組成如圖7所示，結果表明:油脂主要以中性脂為主（主要為三酰甘油），4 cm光徑反應器的中性脂比例為71.4% TL，而6 cm光徑反應器為66.4% TL，然而，6 cm光徑反應器的糖脂和磷脂比例高于4 cm光徑反應器，兩種油脂的顏色均為黑褐色，具有流動性。

圖5 真眼點藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）脂肪酸百分含量的變化

圖6 不同提取條件對真眼點藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）油脂提取率的影響

圖7 真眼點藻油（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）的脂類組成

藻油的脂肪酸可以影響其下游應用，由表1為兩種光徑生物反應器藻油的脂肪酸組成，4 cm和6 cm光徑反應器都可以積累EPA，其中，6 cm光徑反應器藻油的EPA相對含量可以達到4.0% TFA，而4 cm光徑反應器僅有2.2% TFA，6 cm光徑反應器較4 cm 提高了 81.8%（P＜0.01）。

2.5 產率計算

通過計算真眼點藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）的生物質、總脂和EPA產率，進而評價其戶外生產性能。由表1可知，兩種光徑生物反應器的生物質、總脂和EPA產率最高為4-6 d，隨后均呈現降低趨勢。計算整個周期內的平均產率可知，6 cm光徑反應器的平均生物質產率高于4 cm，增加幅度為13.9%，而對于總脂產率而言，4 cm光徑反應器的平均總脂產率高于6 cm光徑反應器，增加幅度為53.8%，而對于EPA產率而言，6 cm 光徑反應器的產率高于4 cm光徑反應器，6 cm產率達到0.6 mg/L·d，而4 cm僅有0.2 mg/L·d，增加幅度達到200%，可見在生物質和EPA產率上6 cm更加具有優勢，而在促進油脂積累方面4 cm更加具有優勢。

3 討論

3.1 真眼點藻SCSIO-45821（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）的鑒定

經形態學和分子鑒定，真眼點藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）屬于真眼點藻綱（Eustigmatophyceae）、真眼點藻目（Eustigmatales）、真眼點藻科（Eustigmataceae）、真眼點藻屬（Eustigmatos），與波氏真眼點藻（Eustigmatos polyphemCCAP 860/8）具有較近的親緣關系。本研究藻株分離自寧夏高原地區的土壤表面，這與高保燕等［3］報道的真眼點藻經常分布在土壤表面，特別是高原土壤表面的報道一致，真眼點藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）是否與已報道的波氏真眼點藻具有相同的生物學特性，還需要后續更多的實驗驗證。

表1 真眼點藻油的脂肪酸組成（%總脂肪酸）

表2 真眼點藻（Eustigmatos sp. SCSIO-45821）的生物質、總脂和EPA產率

3.2 不同光徑平板式反應器對真眼點藻生長、脂類積累及脂肪酸組成的影響

微藻生長受到各種因素的影響，如藻種特性、光照、溫度、微生物等。任何一種條件的改變，都將導致微藻生物質產率的改變，因此準確的藻種生產性能評價應該在一年或幾年的不同季節進行，進而獲得準確的生物質產率。但為了快速了解藻種的特性，可以選擇天氣較為適宜時間段進行培養，以便快速評斷藻種是否具有產業化潛力，如果該藻株不具有產業化潛力，則無需進行更長時間評價，本研究為了快速了解真眼點藻（Eustigmatossp.SCSIO-45821）的戶外生長性能，評價時間設定為10 d，由于整個培養過程的天氣條件非常穩定（光照、溫度、無污染），因此，培養數據接近該藻株戶外培養較理想的產率數值。

光徑對微藻生長和脂類積累的影響最終來源于光的穿透效率［17］，4 cm光徑反應器具有更窄的光徑，隨著藻細胞密度的增加，其具有較6 cm光徑反應器更好的光線穿透率。培養前期（0-4 d），真眼點藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）在4 cm光徑反應器中的生長速率雖然快于6 cm光徑反應器，但兩種光徑反應器最終生物質濃度并無明顯差異。但通過計算生物質產量發現，6 cm光徑反應器的生物質產量為76.3 g，4 cm光徑反應器僅為46.3 g，這一結果證明4 cm光徑反應器雖然具有更好的光穿透性，但并不能獲得更高的生物質產量，我們推測這可能與真眼點藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）的強光適應性有關，在培養周期內，白天正午光強最強可以達到約1 200 μmol photons/m2s，上述強光在短時間內都可能造成藻細胞光系統的損傷，從而抑制微藻生長，布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）UTEX 572和UTEX 2441的光飽和點分別為800 μmol photons/m2s和 400 μmol photons/m2s［18］，雨生紅球藻 712 株系游動細胞的光飽和點為 320 μmol photons/m2s［19］，1 200 μmol photons/m2s超過了多數微藻的光飽和點，如果微藻接受的光強長時間處于光飽和點以上，將會導致細胞光損傷［20］。真眼點藻綱微藻常用的培養光強為 150-350 μmol photons/m2s［4-5］，目前還沒有真眼點藻強光適應性的報道。因此，建議戶外條件下利用平板光生物反應器培養真眼點藻，在培養前期應盡量避免日光直射，減少強光對藻細胞的損傷。

本研究表明:4 cm光徑反應器較6 cm光徑反應器更有利于真眼點藻（Eustigmatossp. SCSIO-45821）脂類的積累，4 cm光徑反應器中藻細胞可以接受更強和更長時間的光照，而高光照有利于微藻脂類的積累［21］，Liu 等［22］報道柵藻（Scenedesmusspp.）在400 μmol photons/m2s取得了比 50 μmol photons/m2s和250 μmol photons/m2s更高的總脂含量，與本研究結果一致。但兩種光徑反應器的最高總脂含量均出現在第6天，我們推測這可能與強光照射引起的光損傷有關。積累高含量的EPA是真眼點藻受到關注的原因之一，本研究表明6 cm光徑反應器更有利于EPA的積累。Gao等［9］報道類波氏真眼點藻（E. cf.polyphem）在高光強條件下不利于EPA的積累，這與本研究結果一致。高光強不利于EPA積累的原因可能為:EPA通常是一種膜脂組成成分［23］，當強光照射時細胞傾向于分解膜脂，而大量合成儲藏性中性脂，從而導致EPA含量降低。

3.3 利用乙醇提油取真眼點藻油脂

油脂提取是微藻油開發中的重要環節，由于微藻細胞體積較小，難以用物理壓榨法提取微藻油。常用的微藻油脂提取方法是有機溶劑抽提法［10］，氯仿、正己烷、甲醇與丙酮常用于微藻油脂的提?。?4］，但考慮油脂的安全性，上述溶劑使用殘留會導致油脂存在安全風險［12］。乙醇是一種常見的溶劑，廣泛應用于各種活性產物提取當中，潛在風險較?。?3］。本研究結果表明:乙醇可以用于真眼點藻油脂的提取，提取溫度對油脂提取率無明顯影響，高濃度乙醇可以獲得較高的油脂提取效率，提取時間越長，油脂提取率越高，通過單因子優化實驗獲得的較優提取工藝為:100%乙醇、常溫下浸提36 h，可以獲得94.3%的油脂提取率，該技術成本低、安全性高，非常適用于用作食品或保健品原料微藻油脂的提取，乙醇可以提取油脂的原因可能是乙醇導致細胞膜上出現空隙，使細胞內油脂更容易提取［14］。后續我們將開展正交實驗或者響應面實驗進一步優化油脂提取條件，并嘗試利用濕藻泥進行研究，為更大規模油脂提取工藝提供參考依據。

衡量油脂品質的指標有多種，包括脂肪酸組成、脂類種類、油脂、酸值等，本研究乙醇提取的油脂中含有超過70% TL的中性脂和4.0% TFA的EPA，是一種具有潛在價值的食品與保健品原料，但該粗油脂也存在明顯的缺點，油脂中含有高含量的葉綠素而呈現暗黑色，較差的顏色將嚴重影響其下游應用［25］。真眼點藻油需要進行脫色與精煉，提高品質，與油脂品質相關的其他因素（如酸價、流動性、重金屬等），我們將在后續的研究中進行分析。

3.4 真眼點藻SCSIO-45821（Eustigmatos sp.SCSIO-45821）的戶外生產性能

生物質產率是評價微藻是否具有產業化潛力的關鍵指標，4 cm和6 cm光徑反應器的生物質產率分別為80.5 mg/L·d和93.5 mg /L·d，Gao等［9］報道類波氏真眼點藻（E. cf.polyphem）在室內平板式光生物反應器（24 h光照，熒光燈提供光源）中的生物質產率可以達到570 mg/L·d，本研究結果遠遠小于上述結果，原因可能為:（1）戶外光照時間并非24 h，藻細胞受光時間少，特別是在夜晚無光的條件下，藻細胞可能會分解白天積累的物質，而使生物質濃度降低；（2）光照強度不穩定，過量的光照可能抑制藻細胞生長；（3）細菌或真菌的影響。如果獲得更加準確的戶外評價數據，需要進行長時間、多批次的評價工作。不考慮多組平板式反應器的空間布局問題，根據單組平板式反應器的占地面積為0.3 m2，可以計算4 cm和6 cm光徑反應器中單位面積生物質產率僅有24.2 g/m2·d和28.1 g/m2·d，目前未見將真眼點藻進行戶外跑道池培養的實例，但同屬真眼點藻的擬微綠球藻的戶外培養報道較多，Crowe等［26］報道在戶外開放池的生物質產率僅有3.3 g/m2·d，可見光生物反應器的培養效率遠高于跑道池。如果按照每年300 d計算，4 cm（體積為48 L）和6 cm（體積為72 L）光徑反應器每年分別可以生產2.02 kg和1.16 kg藻粉，由此可見，6 cm光徑反應器更加適宜真眼點藻的培養。如果促使真眼點藻生產油脂，建議采用兩步培養法，首先利用光徑較大的平板光生物反應器，獲得較高的細胞密度，隨后將微藻轉入窄光徑平板光生物反應器中誘導油脂積累。

4 結論

真眼點藻SCSIO-45821可以利用戶外平板式光生物反應器進行培養，在生物質和EPA產率上6 cm光徑反應器更加具有優勢，而在促進油脂積累方面4 cm光徑反應器更加具有優勢。利用100%乙醇常溫下提取真眼點藻油脂可以獲得94.3%的提取率，所提油脂含有超過70% TL的中性脂與4.0% TFA的EPA，但藻油顏色需要進一步處理。