心理應激對雌性小鼠胃泌素、雌激素及其胃食管炎癥因子的影響

阿孜古麗·阿力木江 買買提·依斯熱依力 王婧 艾克拜爾·艾力 陸萍克力木·阿不都熱依木

前 言

胃食管反流病（gastroesophageal reflux diseases，GERD）是一種臨床實踐中常見的慢性上消化道疾病，其發病率逐年增高［1］。導致GERD的因素較多，如老齡化、自身免疫、焦慮、抑郁及生活方式等均可引起該疾病，但其發病機制尚未明確。據報道，焦慮抑郁狀態及各種心理應激均與GERD的發生密切相關［2］。研究結果表明，女性GERD患者異常的酸反流和食管運動功能障礙均與胃泌素和雌激素水平變化有關［3］。此外，氧化應激和炎癥因子在GERD發生與發中的作用逐漸受到重視［4］。本研究通過建立心理應激雌性小鼠模型，分析心理應激對雌性小鼠胃泌素及雌激素水平的影響，探討其對氧化應激和食管炎癥發生中的作用。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：20只8周齡，SPF級雌性昆明小鼠，購于新疆實驗動物研究中心［SCXK（新）2011‐0001］，飼養于新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所IVC系統動物中心。采用Microsoft office excel軟件隨機分心理應激組和正常對照組，每組各10只。兩組小鼠單只飼養在自由進食水的鼠籠內，每日給予12h/12h晝夜循環，光照均始于8∶30，止于20∶30。

2.主要試劑與儀器：自制式束縛器和1‐14K型低溫高速離心機（美國Sigma公司生產）；Eclipse E200型光學顯微鏡（日本尼康公司生產）；C1000型梯度PCR擴增儀（美國Bio‐Rad公司生產）；PBS緩沖液粉末、檸檬酸及H&E染色相關試劑均購于北京中杉金橋公司；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司生產）；cDNA合成試劑盒（北京天根有限公司生產）；實時定量RT‐PCR試劑盒（日本TaKaRa公司生產）。

二、慢性束縛應激動物模型的建立

束縛應激施行時間均在每日上午10∶30～12∶30進行，每日限制活動2 h，期間禁食禁水，后放回鼠籠內自由活動，連續束縛應激14 d［5］。10只心理應激組小鼠置于用50 ml離心管所制的自制式束縛器中（離心管提前燙制出直徑約5 mm的通氣孔若干，分布于左右及上側管壁）。正常對照組小鼠自由飲水攝食，其余時間兩組小鼠處理相同。

三、取材與標本處理

心理應激第14天17∶00開始對各組小鼠禁食，于次日11∶00腹腔內注射戊巴比妥鈉，150毫克/千克進行麻醉并取材。麻醉的小鼠以平臥位固定，從腹部正中至劍突取切口3 cm切口，下腔靜脈取血注入于1.5 ml EP管中，全段食管組織剪斷取材。

四、組織病理學處理及炎癥評價

兩組小鼠食管組織置于4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚切片行H&E染色，并觀察分析兩組食管組織形態學改變并進行炎癥評價［6］。

五、酶聯免疫吸附法

實驗結束當天取每組小鼠全血標本，放入含有15 g/L乙二胺四乙酸的采血管內，血液標本在采集后的30 min內于4℃、3000×g離心10 min，取上清，并置于?80℃冰箱中保存。采用酶聯免疫吸附法檢測血清胃泌素、雌二醇等激素的含量以及NADPH 氧化酶‐4（NADPH oxidase，Nox‐4）、白介 素 ‐1β （Interleukin‐1β， IL‐1β）、 白 介 素 ‐6（Interleukin‐6，IL‐6）以及腫瘤壞死因子‐α（Tumor necrosis factor‐α，TNF‐α）等的含量。實驗過程及測量指標濃度的計算嚴格按試劑盒說明書進行。

六、實時定量RT‐PCR

采用實時定量RT‐PCR方法檢測Nox‐4、IL‐1β、IL‐8及TNF‐α等指標的mRNA的相對表達。取兩組每只小鼠食管組織40 mg，采用TRIzol試劑提取總RNA，采用天根公司Fast Quant RT試劑盒合成第一鏈cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成引物，各指標及β‐肌動蛋白（actin）引物序列和擴增產物長度見表1。實時定量RT‐PCR，反應體系為 20 μl，按照 94 ℃ 3 min，95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s，共40循環設置反應條件。反應結束后由電腦自動得出熒光曲線及Ct值，采用2—△△Ct計算出目標基因的相對表達倍數。

表1 實時定量RT‐PCR引物序列及產物長度

七、統計學分析方法

采用SPSS22.0軟件處理數據。符合正態分布的計量資料均以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、心理應激對激素水平的影響

酶聯免疫吸附（ELISA）實驗結果顯示，14d的束縛應激后，小鼠血液中胃泌素（圖1A）和雌二醇（圖1B）激素水平顯著降低，較對照組比較，兩者的差異有統計學意義（t=4.265，5.622；P＜0.05）。

圖1 兩組小鼠血清激素水平比較（每組n=10，aP＜0.05 vs正常組）

二、心理應激對食管組織的影響

心理應激組小食管粘膜層可見基底細胞增生，中性粒細胞、嗜酸性粒細胞及漿細胞浸潤反應和炎癥性改變，提示食管上皮受到外界因素損傷后的表現及增生修復反應（圖2A）。心理應激組小鼠食管粘膜炎癥細胞評分明顯高于對照組（圖2B），兩組比較的差異有統計學意義（t=7.512，P＜0.05）。

圖2 兩組食管粘膜組織H&E染色

三、心理應激引起氧化應激水平上升

RT‐PCR和酶聯免疫吸附（ELISA）實驗結果顯示，心理應激組小鼠食管粘膜組織NADPH氧化酶‐4（NADPH oxidase，Nox‐4）的mRNA相對表達（圖3A）及其血液中（圖3B）的表達水平顯著上升，與對照組相比，差異有統計學意義（t=5.546，6.013；P＜0.05）。

圖3 兩組食管組織Nox‐4的表達水平比較（n=10，aP＜0.05 vs正常組）

四、慢性束縛應激引起炎癥因子表達上升

心理應激組食管粘膜組織IL‐1β、IL‐6及TNF‐α的mRNA轉錄水平顯著高于對照組（圖4），兩組比較的差異有統計學意義（t=7.124，5.876，6.832；P＜0.05）。酶聯免疫吸附結果顯示，血液中心理應激組炎癥因子IL‐1β、IL‐6、TNF‐α的釋放水平明顯上升（圖5），與對照組相比差異有統計學意義（t=2.317，4.681，8.105；P＜0.05）。

圖4 兩組食管組織炎癥因子mRNA表達水平的比較（n=10，aP＜0.05 vs正常組）

圖5 兩組血清炎癥因子水平比較（n=10，aP＜0.05 vs正常組）

討 論

CERD的病理生理機制有多種因素參與，包括遺傳、環境、解剖、激素、神經因素等，但其詳細機制目前尚不清楚。胃食管反流是一種生理現象，只有出現反流癥狀或并發癥時才稱作反流性疾病［7］。胃酸是食管黏膜的主要損傷因素。食管黏膜與酸接觸后，局部血流和組織內胃泌素分泌異常，從而黏膜對酸的易感性增強。反復的酸刺激使黏膜發生炎癥，最終導致食管炎。食管內酸化會影響吞咽頻率、食管黏膜完整性和食管原發性蠕動［8］。研究發現，胃泌素與GERD的發生機制密切相關，胃泌素分泌不足可以導致下食管括約肌（Lower esophageal sphincter，LES）功能不全，進而增加GERD發病風險。因此，若血清胃泌素水平較低，可以初步提示GERD，特別是內鏡陽性的反流性食管炎［9］。但由于各研究納入的病例組不同，特別是NERD是否納入，血清對GERD診斷界限值和診斷效能參差不齊。

從食管的解剖學來看食管下段完全由平滑肌構成，GERD患者的食管動力學改變特點與食管平滑肌的分布特點和平滑肌的收縮功能密切相關［10］。胃泌素是一種重要的胃腸激素，它主要由G細胞分泌，具有刺激胃酸分泌、促進胃腸道細胞增殖和分化等生理功能。體內胃泌素分泌水平主要受G細胞數量、胃內pH值、刺激迷走神經、胃竇牽拉、服用抑酸藥和促胃泌素激素藥物等諸多因素影響。胃泌素可以維持食管下括約肌壓力，防止胃食管反流。研究結果表明，胃泌素通過結合LES平滑肌上的CCK‐2受體，促進LES的收縮，促進食管平滑肌推進性蠕動，從而防止酸反流［11］。胃泌素不全或水平降低是引起LES功能不全的重要因素。Suzuki等［12］發現，GERD患者血液中胃泌素水平及LES收縮能力顯著低于健康對照組。血清胃泌素低值是胃食管反流病的預測指標其原理可以概括為兩點。其一，低胃泌素血癥是GERD發生機制之一。其二，GERD是一種酸相關性疾病，多數患者處于高胃酸狀態，基礎胃酸分泌量較高；由于胃酸的反饋性抑制作用，胃竇G細胞分泌胃泌素減少，血清胃泌素相應降低。既然GERD是一種酸相關性、動力障礙性疾病，因此胃泌素與其發病機制關系密切，為臨床診斷提供一種可能。因此，胃泌素分泌異常可能是GERD發生的機制之一。此外，絕經后老年婦女因卵巢萎縮，血清雌二醇含量減低，導致食管胃粘膜屏障功能削弱，粘液分泌減少，微循環障礙，對胃酸反流、膽汁酸和外源性刺激敏感性增強，進而引起GERD的發生［13］。對老年女性GERD防治，除使用促動力劑、抑酸劑外加用雌激素補充療法可望改善癥狀，提高療效。Naik等［14］的研究結果表明，雌、孕激素對LES壓力具有松弛效應，在妊娠期女性中可引起LES功能降低，而出現GERD相關癥狀的加重。

過量產生的氧化應激和炎癥反應在GERD發生與發展中的作用逐漸受到重視。氧化應激‐炎癥‐衰老，三者的形成機制互為因果關系；當機體氧化、抗氧化能力出現紊亂時，可使炎癥反應和促炎癥因子的大量釋放，最終導致機體持續處在過度炎癥狀態［15］。炎性細胞因子在GERD發生中的作用逐漸成為學者們關注的焦點。氧化應激是由活性氧過量生成或細胞內抗氧化防御系統受損導致氧自由基及其相關代謝產物過量聚集，從而對機體造成損害的病理狀態［16］。既往研究顯示，心理應激反應是誘導活性氧過量產生的的重要機制，在GERD的進程中發揮著重要作用［17‐19］。近年來，焦慮、抑郁等精神心理異常因素常發現與下丘腦‐垂體‐卵巢軸的神經內分泌功能失調，性激素（雌二醇、促黃體生成素）分泌異常、排卵功能障礙等有關［20‐21］。本研究發現，與對照組比較，心理應激小鼠血液中胃泌素、雌二醇等激素水平更低；食管粘膜組織炎癥評分更高；氧化應激和炎癥因子水平增高，這結果提示心理應激誘導激素水平的異常分泌，促進食管氧化應激和炎癥損傷。

綜上所述，胃泌素以及雌二醇與GERD的發生機制密切相關。心理應激增加罹患GERD的風險，會導致GERD癥狀的加重。本研究結果顯示，心理應激誘導雌性小鼠胃泌素和雌二醇水平降低，促進食管氧化應激產生及其炎癥發生，可能是心理壓力相關GERD的發病機制之一，但其分子機制仍有待進一步探索。