表觀健康兒童人類白細胞分化抗原B27參考區間的建立

張 利，葛 亮，張蘭芳，馬小力，孫林春

（1.江蘇省中醫藥研究院 南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院檢驗科，江蘇 南京 210009；2.南京醫科大學附屬兒童醫院兒科研究所，江蘇 南京 210008）

人白細胞抗原B27（human leukocyte antigen-B27，HLA-B27）與成人強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）密切相關，甚至直接參與了AS的發病。BREWERTON等[1]的研究結果顯示，HLA-B27與AS之間有很強的遺傳相關性，AS患者中HLA-B27的陽性率可達90%。此外，HLA-B27在其他脊椎關節病，如反應性關節炎[2]、銀屑病關節炎[3]等患者中的陽性率也高于正常人。因此，HLA-B27對脊柱關節病的診斷和鑒別診斷有重要的參考價值。流式細胞術是目前檢測外周血淋巴細胞HLA-B27表達的主要方法，但尚缺乏統一的參考區間，各臨床實驗室多采用試劑廠家提供的參考區間，也有一些臨床實驗室自行建立參考區間，但這些參考區間均只針對成年人群，尚未見兒童HLA-B27參考區間的報道[4]。風濕免疫學專家大多認為幼年起病的慢性關節炎是一種異質性疾病，以往這類疾病分類無統一標準，尤其是脊柱關節疾病的命名更為混亂。國際風濕病學會聯盟（the International League of Associations for Rheumatology，ILAR）于2004年正式發布了幼年特發性關節炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）的定義：16歲以下兒童持續6周以上，且排除其他疾病的不明原因關節腫脹，稱為幼年特發性關節炎[5]。ILAR發布的相關標準中將JIA分為7個亞型，將以往概念中的幼年強直性脊柱炎歸入JIA的附著點炎癥相關型（enthesitis related arthritis，ERA）。目前，大多研究認為7個JIA亞型中，只有ERA與HLA-B27密切相關，ERA患兒成年后大多進展為AS[6]。近年來，HLA-B27對兒童ERA的輔助診斷作用逐漸得到臨床的認可和重視。然而，兒童由于免疫系統尚未發育完全，HLA-B27的參考區間較成人可能存在較大差異，建立兒童HLA-B27的參考區間對于指導臨床診療至關重要。為此，本研究擬建立南京地區表觀健康兒童HLA-B27的參考區間，并將其與廠商提供的參考區間作比較，探討二者之間的差異，以期為臨床診療提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 參考區間建立人群 選取2015—2018年在南京醫科大學附屬兒童醫院因病就診或進行健康體檢的兒童460例，其中男255例、女205例，年齡2～16歲，其中<3歲19例、3～<6歲95例、6～<12歲248例、≥12歲98例。根據臨床診斷，460例兒童中上呼吸道感染251例、腹瀉88例、下呼吸道感染72例、先天性心臟病25例、腺樣體肥大24例。所有兒童均無ERA自覺癥狀，體格檢查示無脊柱、外周關節、關節周圍組織炎癥或其他病變，且相關實驗室指標無異常，排除可能對會對HLA-B27檢測結果造成影響的疾病。

1.1.2 參考區間驗證人群 選取2018年1—12月在南京醫科大學附屬兒童醫院行健康體檢的表觀健康兒童200名，其中男121名、女79名，年齡5～14歲，均無ERA自覺癥狀，體格檢查示無脊柱、外周關節、關節周圍組織炎癥或其他病變，實驗室常規檢測項目均無異常。另選取同期南京醫科大學附屬兒童醫院依據ILAR相關標準確診為ERA的患兒50例，其中男27例、女23例，年齡6～15歲。

1.2 儀器和試劑

FACSCantoⅡ流式細胞儀及配套HLA-B27試劑盒、溶血素購自美國BD公司。

1.3 方法

采用乙二胺四乙酸抗凝管采集所有對象清晨空腹靜脈血2 mL，顛倒混勻。取Falcon流式細胞管，加入100 μL外周血，再加入抗HLA-B27/抗CD4-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）抗體，渦旋儀震蕩混勻，室溫避光孵育15 min，加入1 mL 1×溶血素，混勻后室溫避光孵育15 min，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS），1 200×g離心5 min，棄上清，加入0.9% NaCl溶液200 μL重懸細胞，上機檢測，以CD3-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的T淋巴細胞設門，檢測門內細胞HLA-B27表達的平均熒光強度。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。采用單樣本K-S檢驗進行正態性檢驗。呈偏態分布的數據以中位數（M）[百分位數（P2.5～P97.5）]表示，組間均數比較采用非參數Kruskal wallis檢驗。不同參考區間比較采用一致性檢驗，以kappa值判斷2個參考區間的一致性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 460例兒童HLA-B27檢測結果的分布

單樣本K-S檢驗結果顯示，460例兒童的HLA-B27平均熒光強度檢測結果呈偏態分布（Z=1.615，P=0.011），為100（78～121）。

2.2 兒童HLA-B27參考區間的建立

2.2.1 不同年齡兒童HLA-B27平均熒光強度的比較 不同年齡兒童HLA-B27平均熒光強度差異無統計學意義（χ2=3.438，P=0.329）。見表1。

表1 不同年齡兒童HLA-B27平均熒光強度的比較 M（P2.5～P97.5）

2.2.2 不同性別兒童HLA-B27平均熒光強度的比較 不同性別兒童HLA-B27平均熒光強度差異無統計學意義（χ2=3.766，P=0.282）。

表2 不同性別兒童HLA-B27平均熒光強度 M（P2.5～P97.5）

2.2.3 兒童HLA-B27參考區間的建立 由于不同年齡和性別兒童HLA-B27檢測結果差異均無統計學意義（P>0.05），且HLA-B27只在升高時才有臨床意義，因此合并數據后采用百分位數法建立單側97.5%的參考區間。本地區兒童HLA-B27的參考區間為<121。

2.3 本研究建立的參考區間與廠商參考區間的一致性比較

廠商提供的正常人外周血T淋巴細胞HLA-B27平均熒光強度的參考區間為0～147。對2個參考區間進行一致性比較，結果顯示一致性較差（kappa=0.013，P<0.001）。

2.4 新參考區間的驗證

根據廠商提供的參考區間，200名表觀健康兒童中有6名HLA-B27檢測結果為升高，異常率為3%；根據本研究建立的新參考區間，200名表觀健康兒童中有10名升高，異常率為5%；共有4名結果不一致，占總人數的2%。二者異常率差異無統計學意義（χ2=1.41，P>0.05）。

根據廠商提供的參考區間，50例ERA患兒中有13例HLA-B27陽性，陽性率為26%；根據本研究建立的新參考區間，50例ERA患兒中有39例HLA-B27陽性，陽性率為78%。二者陽性率差異有統計學意義（χ2=49.18，P<0.001）。

3 討論

流行病學調查結果顯示，AS患者HLA-B27陽性率可高達95%，而正常人群的HLA-B27陽性率在10%以下；HLA-B27攜帶者的AS相對發病風險為70%，HLA-B27陽性的AS患者其一級親屬發生AS的概率是正常家系的11倍，呈現出明顯的家族聚集性[7]。ASQUITH等[8]在轉入人類HLA-B27基因的大鼠中觀察到多種與人類AS相似的臨床表現，而攜帶HLA-B27基因數量少的大鼠則未出現關節炎等AS表現。雖然AS的發病機制不明，但目前已經公認HLA-B27與AS的發病相關。

ERA是兒童常見的慢性風濕性疾病之一，早期癥狀不典型，且未成年人的骨骼尚在發育，一些發育時期關節的正常表現，如骶骨骨骺、關節面的局限性凹陷、髂骨側關節面的囊樣改變也與ERA的病理特征相似[9]，這給臨床診斷增加了難度。近年來，HLA-B27在ERA的輔助診斷中逐漸得到臨床的認可和重視。然而，目前采用的HLA-B27參考區間多為成人參考區間，且由廠商提供。由于兒童有其特有的生長發育規律，與成人之間存在較大的生理差異，因此某些檢測項目的參考區間可能不適用于兒童。我們在實際工作發現，一些被診斷為ERA的患兒，其HLA-B27根據現有的參考區間被判斷為陰性，雖然HLA-B27陽性與ERA之間的符合率并非100%，但這也提示HLA-B27的表達情況在成人與兒童之間可能不完全一致。因此，有必要建立未成年人HLA-B27的參考區間。

本研究用于建立參考區間的兒童均無ERA自覺癥狀，無脊柱、外周關節、關節周圍組織炎癥或其他病變，臨床和實驗室檢查也無其他AS相關指標異常，所得結果能真實、可靠地反映兒童HLA-B27的表達情況。本研究結果顯示，460例兒童外周血T淋巴細胞HLA-B27平均熒光強度數據呈偏態分布，且不同年齡和性別兒童差異均無統計學意義（P>0.05），因此合并數據后采用百分位數法建立單側97.5%的參考區間，結果為<121。建立的新參考區間與廠商提供的參考區間的一致性較差（kappa=0.013，P<0.001）。用2個一致性有顯著差異的參考區間分析同一個檢測結果時，很可能會出現完全不同的結論[10]。為此，本研究另選取200名表觀健康兒童對新參考區間進行驗證。結果顯示，根據新參考區間，200名表健康兒童HLA-B27的異常率為5%，50例ERA患兒的HLA-B27陽性率為78%；根據廠商提供的參考區間，200名表觀健康兒童HLA-B27的異常率為3%，50例ERA患兒的HLA-B27陽性率為26%；二者異常率差異無統計學意義（χ2=1.41，P>0.05），陽性率差異有統計學意義（χ2=49.18，P<0.001）。說明采用2種參考區間得出的HLA-B27特異性均較好，誤診率較低；但采用新參考區間得出的HLA-B27敏感性優于廠商提供的參考區間，使用廠商提供的參考區間可能會造成一部分ERA患兒漏診。

雖然HLA-B27在所有有核細胞表面都表達，但其主要表達于淋巴細胞表面。未成年人的免疫系統尚在發育中，免疫細胞表面抗原可能未分化完全或未充分暴露，這可能導致未成年人淋巴細胞表面HLA-B27平均表達強度低于成人，因此使用成人參考區間可能會造成漏診。由于HLA-B27與兒童ERA高度相關，因此根據參考區間準確判斷HLA-B27陽性對于ERA的輔助診斷和鑒別診斷具有重要價值，尤其是對于依據現有臨床表現和影像學檢查仍難以作出明確判斷的患兒。此外，對有HLA-B27陽性家族史，根據參考區間判斷HLA-B27陽性但尚無ERA臨床癥狀或骨骼改變的兒童，臨床建議定期復查，早期發現，及時采取藥物控制、心理干預、行為干預和運動指導等綜合治療措施，對于成年后延緩疾病進展，提高生活質量有重要作用。

綜上所述，本研究建立了南京地區兒童外周血HLA-B27的參考區間，依據該參考區間診斷ERA的特異性與廠商提供的參考區間無差異，但提高了診斷敏感性，降低了漏診率。