闊葉十大功勞根提取物對(duì)糖尿病模型小鼠降糖作用研究

曹國瓊，洪 林，張永萍

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，由胰島素分泌缺陷和/或其生物作用受損引起，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病[1-2]。近年來由于人們生活節(jié)奏加快、生活方式的改變，代謝性疾病的發(fā)病率正在不斷上升。國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2013年全球糖尿病患者約4.15億，到2040年可能達(dá)到6.42億[3]。目前西藥治療糖尿病主要有二甲雙胍、噻唑烷二酮類藥物、胰高血糖素樣肽類似物和α葡萄糖苷酶抑制劑等，但均存在一定的副作用，如造成腹部不適或腹痛腹瀉，乳酸中毒，肝腎功能衰竭[4]。尋找有效治療糖尿病且副作用少的藥物是廣大醫(yī)藥工作者的責(zé)任。中藥、民族藥使用歷史悠久，著重整體調(diào)節(jié)，不良反應(yīng)少，價(jià)格相對(duì)低廉，可從中尋找DM預(yù)防和治療藥物[5-6]。

闊葉十大功勞俗名又叫土黃連、老虎刺、刺黃連、土黃柏，為小檗科植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fortune)Carr.的葉、根，是貴州苗族常用藥[7]。闊葉十大功勞具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，主要用于濕熱瀉痢、黃疸、目赤腫痛、胃火牙痛、黃疸型肝等疾病的治療[8]。根據(jù)苗藥藥性理論，其性冷，屬熱經(jīng)，無毒，質(zhì)征苦，入肺、肚、腎三臟。苗藥的治療原則為熱病冷治，闊葉十大功勞可用于治療熱病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，闊葉十大功勞主要含生物堿類成分，如小檗堿、巴馬亭、氧化小檗堿、黃連堿等，這些化學(xué)成分與黃連所含成分相似，故常被用作黃連的替代品[9]。藥理研究表明，黃連具有降血糖的作用，其所含小檗堿通過提高胰島素受體的表達(dá)、促進(jìn)糖酵解、增強(qiáng)胰島素敏感性、促進(jìn)胰島素的釋放與分泌、增加肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗等途徑在降糖方面發(fā)揮重要作用[10-12]。因此，研究闊葉十大功勞的降血糖作用，有利于其資源的開發(fā)利用。闊葉十大功勞根的抗糖尿病研究還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)主要研究闊葉十大功勞根提物的降血糖活性及其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥材與試劑

樣品采自貴州清鎮(zhèn)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥民族藥資源研究院肖承鴻老師鑒定為小檗科十大功勞屬植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fortune.)Carr.，根烘干，粉碎成粗粉，過一號(hào)篩備用；鹽酸二甲雙胍片(昆山培力藥品有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：1703036)；無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ，批號(hào)79C-0027)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醇(MDA)均購于南京建成生物工程研究所(批號(hào)20190710)；還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒購于索萊寶生化試劑公司(批號(hào)20190712)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明小鼠清潔級(jí)50只，雌雄各半，體質(zhì)量25～30 g，購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0011。

1.3 主要儀器

血糖測(cè)試儀(可孚)；METTLER AE240型電子分析天平(瑞士梅特勒)；BIO-RAD酶標(biāo)儀(美國伯樂)；恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；JM-A10002型電子天平(諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司)；HBM-109型粉碎機(jī)(瑞安市瀚博機(jī)電有限公司)；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器有限公司)。

2 方法

2.1 闊葉十大功勞根提取物制備

水提物的制備：稱取一定量的闊葉十大功勞根粗粉，分別用10、8倍量的水煎煮提取2次，每次1 h，合并濾液，減壓回收蒸干，即得水提物。醇提物的制備：稱取一定量闊葉十大功勞根粗粉，分別用10、8倍量的乙醇回流提取2次，每次1 h，合并濾液，減壓回收蒸干，即得醇提物。提取物放入4 ℃冰箱中備用，臨用前稀釋成所需濃度。

2.2 糖尿病小鼠模型制備、分組與給藥[13]

采用檸檬酸緩沖液配制STZ溶液，濃度為150 mg/10 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射STZ，注射量10 g/0.1 mL，正常對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的上述緩沖溶液，注射前均禁食不禁水12 h，注射后禁食禁水。于注射STZ 3 d后取尾靜脈血測(cè)小鼠的血糖值，血糖值高于11 mmol/L，認(rèn)為造模成功。將造模成功的糖尿病小鼠分為4組，每組8只，雌雄各半，分別為模型組、陽性對(duì)照組(鹽酸二甲雙胍組)、水提物組(闊葉十大功勞根)、乙醇提物組(闊葉十大功勞根)。每天灌胃給藥1次，正常組和模型組灌胃給予等量的蒸餾水，給藥后6 h恢復(fù)正常給食，連續(xù)28 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

小鼠連續(xù)灌胃給藥4周，每周測(cè)定小鼠體重。

小鼠空腹血糖檢測(cè)：從給藥第1天起，每7天最后一個(gè)晚上禁食不禁水，于第2天早上尾部采血，測(cè)定其空腹血糖值，連續(xù)4周觀察小鼠血糖變化。灌胃4周結(jié)束后摘眼球采血，離心取血清待測(cè)；處死小鼠，迅速取肝臟，-80 ℃凍存。

小鼠血清和肝臟生化指標(biāo)檢測(cè)：按照試劑盒的操作步驟分別檢測(cè)各組小鼠血清中三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，以及血清及肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)及過氧化物丙二醛(MDA)水平。

2.4 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 闊葉十大功勞根提取物對(duì)小鼠體重變化的影響

對(duì)照組小鼠正常飼養(yǎng)，體重逐漸增加，模型組小鼠造模成功后日漸消瘦，造模兩周后與對(duì)照組比較體重顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥組小鼠給藥4周后體重顯著增加(P<0.05)，闊葉十大功勞提取物對(duì)小鼠的體重影響不大，與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 闊葉十大功勞根提取物對(duì)小鼠體重變化的影響

3.2 闊葉十大功勞根提取物對(duì)糖尿病小鼠血糖變化的影響

實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)照組小鼠4周內(nèi)的血糖均在5～6 mmol/L之間，無明顯變化。造模成功后小鼠的空腹血糖明顯升高，與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。給藥治療后，陽性藥組，根水提物和醇提物組小鼠血糖均得到控制，二甲雙胍、水提物、醇提物給藥治療1周后與模型組比較血糖顯著降低(P<0.05)，連續(xù)給藥4周后陽性藥組、醇提物組小鼠與模型組比較血糖出現(xiàn)極顯著降低(P<0.01)，血糖值接近對(duì)照組。結(jié)果見表2。

表2 闊葉十大功勞根提取物對(duì)糖尿病小鼠血糖變化的影響

3.3 闊葉十大功勞根提取物對(duì)糖尿病小鼠血脂代謝的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平顯著升高(P<0.05)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平極顯著降低(P<0.01)。治療4周后，陽性藥組、提取物組小鼠血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平顯著降低(P<0.05)，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平極顯著升高(P<0.05、0.01)。見表3。

表3 闊葉十大功勞根提取物對(duì)糖尿病小鼠血脂代謝的影響

3.4 闊葉十大功勞根提取物對(duì)糖尿病小鼠血清SOD、GSH、MDA的影響

與對(duì)照組比較，糖尿病模型組小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、還原性谷胱甘肽(GSH)水平顯著降低(P<0.05)，丙二醇(MDA)水平顯著升高(P<0.05)。治療4周后，與模型組相比，陽性藥組、根提取物組小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、還原性谷胱甘肽(GSH)水平顯著升高(P<0.05)，丙二醇(MDA)水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 闊葉十大功勞根提取物對(duì)糖尿病小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

3.5 闊葉十大功勞根提取物對(duì)糖尿病小鼠肝臟SOD、GSH、MDA的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、還原性谷胱甘肽(GSH)水平顯著降低(P<0.05)，丙二醇(MDA)水平顯著升高(P<0.05)。治療4周后，與模型組比較，陽性藥組、根提取物組小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、還原性谷胱甘肽(GSH)水平顯著升高(P<0.05)，丙二醇(MDA)水平顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 闊葉十大功勞根提取物對(duì)糖尿病小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響

4 討論

糖尿病是一種胰島素分泌不足或胰島素作用障礙引起高血糖并伴有血脂異常等特征的代謝性疾病，臨床表現(xiàn)為多飲、多尿、多食和消瘦[14-15]。高血糖可導(dǎo)致機(jī)體組織如眼、腎、心臟、血管等的慢性損害和功能障礙。糖尿病患者長(zhǎng)期碳水化合物、脂肪以及蛋白質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致糖尿病微血管并發(fā)癥和大血管并發(fā)癥的發(fā)生，嚴(yán)重威脅人類的健康。研究表明，氧化應(yīng)激在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，氧化應(yīng)激主要通過損傷胰島β細(xì)胞與誘導(dǎo)胰島素抵抗誘發(fā)糖尿病，體內(nèi)血脂異常會(huì)加重氧化應(yīng)激[16-17]。因此，調(diào)節(jié)體內(nèi)異常的血脂水平和抗氧化應(yīng)激可起到改善或治療糖尿病的作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，十大功勞能抑制鄰苯三酚的自氧化速度，并能清除Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基，其所含多糖和生物堿能清除ABTS·+和DPPH自由基具有抗氧化作用[18-20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明闊葉十大功勞根提取物具有一定的降糖作用。在腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中，灌胃給藥闊葉十大功勞根水提物、醇提物治療后可顯著降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖。在調(diào)節(jié)血脂方面，闊葉十大功勞根提取物能下調(diào)糖尿病模型小鼠血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平，上調(diào)高密度脂蛋白(HDL-C)水平，具有調(diào)節(jié)血脂異常的功能。在抗氧化應(yīng)激方面，闊葉十大功勞根提取物能降低糖尿病小鼠血清中丙二醛(MDA)水平，升高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)活性，改善氧自由基的氧化損傷。

綜上所述，闊葉十大功勞根提取物具有明顯的降血糖作用，并能通過降低血清游離脂肪酸水平抑制氧化應(yīng)激，起到控制血糖的作用，本研究結(jié)果為闊葉十大功勞根用于糖尿病的防治提供了依據(jù)。