蛤蚧不同炮制品的抗疲勞作用研究

黃馨慧，熊桂玉，劉舒凌*，王曉珊，張 兵，朱明鳳

(1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001)

蛤蚧為壁虎科動物蛤蚧GekkogeckoLinnaeus除去內(nèi)臟的干燥體，其性平味咸，歸肺、腎經(jīng)，具有補肺益腎、納氣定喘、助陽益精的功效，常用于肺氣不足、虛喘氣促、勞嗽咳血、陽痿的治療[1]。近年來蛤蚧研究多集中于補腎壯陽、抗腫瘤等藥理研究，并發(fā)現(xiàn)蛤蚧可以增強機體免疫力、抑制腫瘤細胞生長、促進造血功能、清除機體內(nèi)的自由基[2]，而對蛤蚧及其不同炮制品的抗疲勞作用的研究較少。蛤蚧不同炮制品是否均有抗疲勞作用，不同炮制品的抗疲勞作用是否有區(qū)別，目前尚無文獻報道。本課題擬研究蛤蚧不同炮制品(生品、酒制品、油酥制品、蛤粉制品)的抗疲勞作用，以期為蛤蚧炮制品的臨床合理應用，以及闡明其炮制原理提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級昆明種小白鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK(湘)2016-0002。

1.2 藥物與試劑

蛤蚧購于安徽亳州中藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室樊蘭蘭副研究員鑒定為壁虎科動物蛤蚧(GekkogeckoLinnaeus)的干燥藥材。金匱腎氣丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，18030641)；會稽山紹興花雕酒特醇紹興花雕酒(會稽山紹興酒股份有限公司，20161117)；金龍魚芝麻油(益海嘉里(武漢)糧油工業(yè)有限公司，LH20160122)；蛤粉(廣西仙茱中藥科技有限公司，20170620)；乳酸測試盒(南京建成生物工程研究所，20190305)；尿素檢測試劑盒(寧波瑞源生物科技有限公司，2019012901)；肝/肌糖原試劑盒(南京建成生物工程研究所，20190511)。

1.3 儀器與設備

高速中藥粉碎機(瑞安市永歷制藥機械有限公司，111B)；小型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf，5430 R)；電子天平(德國賽多利斯公司，BP211D)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣儀科學儀器有限公司，DHG-9140A)；電炒鍋(廣西柳州龍騰電器廠，LT-116)；全自動生化儀(羅氏集團，P800型)；紫外可見分光光度計(美國安捷倫公司，Aglient8453)。

2 方法

2.1 樣品制備

蛤蚧樣品制備：取干燥蛤蚧除去鱗片、足，齊眼處切去頭，切成大小均勻的小塊。酒蛤蚧樣品制備：取凈蛤蚧塊用黃酒浸潤后，加熱烘烤至外表微黃時，取出放涼，每100 g蛤蚧，用黃酒20 g[3]。油酥蛤蚧樣品制備：取凈蛤蚧，涂以麻油，烘至稍黃質(zhì)脆，去頭(齊眼處切除)、足及鱗片，切成小塊[4]。蛤粉炒蛤蚧樣品制備：取凈蛤蚧塊，照蛤粉燙制法，燙至黃色，質(zhì)酥脆，取出，篩去蛤粉[5]。將以上各炮制品分別打粉，過60目篩，貯存于4 ℃冰箱備用，使用前用生理鹽水配成相應濃度。

2.2 動物分組、給藥及篩選

小鼠按體重隨機分為6組，即空白組、陽性組、蛤蚧組、酒蛤蚧組、油酥蛤蚧組、蛤粉制蛤蚧組。陽性組(金匱腎氣丸)給藥劑量1.3 g/kg，蛤蚧組、酒蛤蚧組、油酥蛤蚧組、蛤粉制蛤蚧組的給藥劑量為1.2 g/kg，小鼠灌胃體積是0.2 mL/10 g/只，空白組灌胃等體積蒸餾水，每天灌胃1次，灌胃給藥21 d。在給藥期間，小鼠每周進行1～2次適應性游泳訓練，剔除不會游泳的小鼠。各組篩選出游泳訓練合格小鼠進入下一步實驗。

2.3 小鼠負重力歇游泳時間測定

取小鼠72只，分組、給藥及篩選參照“2.2”項。末次給藥30 min后，在小鼠尾巴上負荷其體重7%的鉛絲，放入裝有水溫(25±2) ℃、水深40～50 cm的大鐵桶中進行負重力竭游泳。記錄小鼠游泳開始至完全沉入水中10 s仍不能沖出水面的時間，即為負重力歇游泳時間。

2.4 小鼠游泳后血清乳酸含量測定

取小鼠72只，分組、給藥及篩選參照“2.2”項。末次給藥30 min后，將小鼠放入裝有水溫(25±2)℃、水深40～50 cm的大鐵桶中進行無負重游泳10 min，取出后立即用干毛巾擦干小鼠眼睛周圍，隨即摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，檢測血清乳酸含量。

2.5 小鼠游泳后血清尿素氮含量測定

取小鼠72只，分組、給藥及篩選參照“2.2”項。末次給藥30 min后，末次給藥30 min后，將小鼠放入裝有水溫(25±2)℃、水深40～50 cm的大鐵桶中進行無負重游泳90 min，取出后休息30 min后，立即摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，檢測血清尿素氮含量。

2.6 小鼠游泳后肝糖原含量測定

取小鼠60只，分組參照“2.2”項。各組連續(xù)灌胃給藥21 d，末次給藥30 min后，處死小鼠，取新鮮肝臟，用生理鹽水漂洗，濾紙拍干后，按肝糖原試劑盒說明書進行肝糖原測定。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 對小鼠負重力歇游泳時間的影響

與空白組對比，金匱腎氣丸組、蛤蚧組、酒蛤蚧組、油酥蛤蚧組、蛤粉制蛤蚧組小鼠的負重力歇游泳時間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與蛤蚧組相比，油酥蛤蚧、蛤粉制蛤蚧雖然游泳時間高于蛤蚧組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 蛤蚧不同炮制品對小鼠負重力歇游泳時間的影響

3.2 對小鼠游泳后血清乳酸水平的影響

與空白組比較，金匱腎氣丸組、蛤蚧各炮制品組小鼠運動后的血清乳酸含量顯著降低(P<0.01)。與蛤蚧組比較，金匱腎氣丸組、油酥蛤蚧組的血清乳酸含量明顯升高(P<0.05)。酒蛤蚧、蛤粉制蛤蚧的血清乳酸與蛤蚧組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 蛤蚧不同炮制品對游泳后小鼠血清乳酸含量的影響

3.3 對小鼠游泳后血清尿素氮水平的影響

與空白組相比，金匱腎氣丸組尿素氮水平顯著降低(P<0.05)，蛤蚧不同炮制品組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與蛤蚧組相比，酒蛤蚧組尿素氮含量顯著升高(P<0.05)，油酥蛤蚧組、蛤粉制蛤蚧組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 蛤蚧不同炮制品對游泳后小鼠血清尿素氮含量的影響

3.4 對小鼠肝糖原含量的影響

與空白組相比，蛤蚧不同炮制品組能升高肝糖原含量(P<0.05)。與蛤蚧組相比，酒蛤蚧組、油酥蛤蚧組、蛤粉制蛤蚧組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表4。

表4 蛤蚧不同炮制品對小鼠肝糖原含量的影響

4 討論

蛤蚧生品味腥，質(zhì)地柔韌，不易粉碎調(diào)劑。蛤蚧炮制后可以矯臭矯味，改善口感，便于粉碎和調(diào)劑。蛤蚧炮制方法有多種，傳統(tǒng)炮制技術(shù)有酒制、酥制、醋制等，少數(shù)民族尚有醋浸烤制、奶油烤制等方法[6]。蛤蚧生品以補肺益精、納氣定喘見長，為肺腎兩虛、腎不納氣、久咳虛喘要藥，常用于肺虛咳嗽或腎虛作喘[7]。蛤蚧酒浸焙、酒浸酥炙借酒行藥勢增強補腎的作用，多用于腎陽不足、精血虧損的陽痿[8]。油酥蛤蚧，腥氣減少，氣香，便于粉碎，其功效為補腎益肺、納氣定喘，常用于肺虛咳嗽或腎虛作喘的治療[9]。用蛤粉燙制蛤蚧可增強止咳平喘的作用[10]。

疲勞是由于運動引起機體生化改變，從而降低了肌肉力量。評價疲勞的方法有耐力實驗和生化指標檢測，小鼠負重力竭游泳時間是評定抗疲勞特性中最常用的指標，是體能的綜合表現(xiàn)[11]，本實驗中小鼠服用蛤蚧各炮制品均沒有延長小鼠負重游泳的時間。影響小鼠游泳時間的因素很多，如小鼠游泳難以保證其具有相同的運動節(jié)奏，部分小鼠在剛下水后極力掙扎，運動速度快且激烈，易縮短游泳時間。因此不能憑單項實驗數(shù)據(jù)而否認蛤蚧不同炮制品的抗疲勞作用，需綜合考量才能判定蛤蚧不同炮制品是否具有抗疲勞作用。

劇烈運動時，機體相對缺氧，可加快糖酵解，產(chǎn)生大量乳酸，使H+濃度上升、pH值下降，導致機體疲勞[12]。乳酸在體內(nèi)的積聚取決于乳酸的產(chǎn)生與消除速度，減少乳酸的產(chǎn)生或加快乳酸的消除速度，都可延緩疲勞發(fā)生或加快疲勞的消除。能源耗竭是疲勞產(chǎn)生的重要原因之一，糖原作為機體中的重要能源物質(zhì)可以反映疲勞發(fā)生的快慢和程度[13]。分析本實驗研究結(jié)果，可知小鼠連續(xù)服用21 d蛤蚧不同炮制品后，能夠顯著降低血清乳酸的含量，升高肝糖原含量，表明蛤蚧各炮制品均具有緩解疲勞的作用，但各炮制品組與蛤蚧組的區(qū)別不大。

血清尿素氮含量可以反映機體肌肉蛋白質(zhì)的分解和合成代謝情況，可以用于分析與評價機體在大強度運動條件下體力負荷承受能力的狀況[14]。機體長時間不能通過糖、脂肪分解代謝得到能量，加快蛋白質(zhì)與氨基酸分解代謝速度，使血中尿素氮含量增加[15]。本實驗研究結(jié)果顯示，小鼠在大強度耐力運動游泳后，服用蛤蚧、油酥制蛤蚧、蛤粉制蛤蚧的小鼠血清尿素氮含量與空白組比較無統(tǒng)計學差異，服用酒蛤蚧組的小鼠血清尿素氮含量高于空白組。推測原因可能為蛤蚧是富含蛋白質(zhì)類的藥物，小鼠長期服用可能會造成運動后血清尿素氮的含量增加。

綜上所述，服用蛤蚧不同炮制品能減少運動后血清中的乳素堆積量、提高肝糖原含量，蛤蚧不同炮制品在一定程度上具有緩解疲勞的作用。酒蛤蚧、油酥蛤蚧、蛤粉制蛤蚧的抗疲勞作用與蛤蚧有一定區(qū)別，但作用差異不大。尋求蛤蚧不同炮制品的藥效作用差別還需多模型、多指標進一步研究。