金櫻子果肉與果核UPLC特征圖譜與化學(xué)模式識別方法研究

劉燎原，田清清，林偉雄，曾昭君，梁志毅，張志鵬

(廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

金櫻子為薔薇科植物RosalaevigataMichx.的干燥成熟果實(shí)，是花托發(fā)育而成的假果，花托壁厚，內(nèi)有多數(shù)堅硬的小瘦果，內(nèi)壁與瘦果均有淡黃色絨毛[1]。金櫻子需求量連年增加，價格持續(xù)上漲，臨床上去核費(fèi)工費(fèi)時，多數(shù)醫(yī)院寧可不購進(jìn)未炮制好的金櫻子，導(dǎo)致臨床配方缺用[2-3]。關(guān)于金櫻子果實(shí)不同部位多糖等成分含量的差異性分析[4-6]，無法全面表征金櫻子果實(shí)不同部位化學(xué)成分整體的差異性。目前有對金櫻子全果實(shí)的指紋圖譜研究[7-9]，但針對果實(shí)不同部位研究較少。本研究建立一種簡單快速的UPLC檢測方法，能同時測定金櫻子兒茶素含量及特征圖譜，并結(jié)合化學(xué)模式識別方法[10-11]全面評價金櫻子果實(shí)不同部位的差異性，探討金櫻子去核使用的科學(xué)性。

1 儀器與材料

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(TUV檢測器，Empower工作站，Waters公司)；111B型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)(浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)；XP26百萬分之一天平(Mettler Toledo公司)；ME204E萬分之一天平(Mettler Toledo公司)；JJ2000B型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)。

兒茶素對照品(批號：110877-201604，純度99.2%，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、磷酸、乙腈(色譜純，默克股份有限公司)；超純水(Mili-Q Direct，默克股份有限公司)；其余試劑均為分析純。

11批金櫻子經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，符合2015年版《中國藥典》一部金櫻子項下相關(guān)規(guī)定，產(chǎn)地分別來自廣西、江西、湖北、湖南等地。金櫻子全果實(shí)編號為S1～S11，果肉編號為Y1～Y11，果核編號為H1～H11。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters HSS T3 C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流動相為甲醇-0.05%磷酸(4∶96)，等度洗脫，檢測波長為202 nm，體積流量為00.35 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 取兒茶素對照品約4 mg，精密稱定，加甲醇定容至20 mL，得到對照品儲備液濃度為204.947 2 μg·mL-1，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取金櫻子粉末(過三號篩)0.3 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流提取0.5 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 分別精密吸取“2.2.1”項下對照品儲備液0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL，加甲醇定容至10 mL，搖勻，配制成5.123 7、10.247 4、20.494 7、51.236 8、102.473 6 μg·mL-1的對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別測定，以兒茶素的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=40 790.092 3X-17 816.732 2，r=0.999 9，結(jié)果表明兒茶素質(zhì)量濃度在5.123 7～204.947 2 μg·mL-1內(nèi)與峰面積積分線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為20.494 7 μg·mL-1的兒茶素對照品溶液，平行進(jìn)樣6次，按照“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積積分值，兒茶素峰面積積分的RSD為1.27%；以兒茶素峰為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積，各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD< 2%，結(jié)果表明精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次金櫻子粉末，精密稱定，平行稱定6份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別測定，供試品溶液中兒茶素的平均含量為1.555 mg·g-1，RSD為2.42%；以兒茶素峰為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積，各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD< 3%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次金櫻子粉末，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，在0、2、4、6、8、12 h分別測定，測得供試品溶液中兒茶素峰峰面積的RSD為0.66%；以兒茶素峰為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12 h內(nèi)各色譜峰相對保留時間與相對峰面積的RSD< 3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已測定含量的金櫻子樣品，精密稱定，分別精密加入一定量的兒茶素對照品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液9份，按照“2.1”項下色譜條件分別測定，計算兒茶素加樣回收率及RSD值，平均加樣回收率為101.7%，RSD為2.04%，結(jié)果見表1，表明回收率良好。

表1 兒茶素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.4 含量測定

取上述11批金櫻子，分離果肉和果核，取果實(shí)、果肉、果核三個部位，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定。計算金櫻子不同部位中的兒茶素含量，結(jié)果見表2。

表2 金櫻子不同部位中的兒茶素含量測定結(jié)果 (mg·g-1，n=11)

2.5 特征圖譜測定

2.5.1 特征圖譜的建立 取11批果實(shí)、果肉、果核樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定并記錄色譜圖，分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012版)”，生成共有對照特征圖譜(見圖1、圖2、圖3、圖4)，果實(shí)、果肉、果核分別標(biāo)定了13、12、9個共有峰。與對照品對照指認(rèn)12號峰為兒茶素，并以其作為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積，結(jié)果見表3和表4。

表4 金櫻子樣品共有峰相對峰面積

表3 金櫻子樣品共有峰相對保留時間

續(xù)表3

圖1 11批金櫻子果實(shí)UPLC特征圖譜

圖2 11批金櫻子果肉UPLC特征圖譜

圖3 11批金櫻子果核UPLC特征圖譜

A.兒茶素對照品；R(S)果實(shí)；R(F)果肉；R(E)果核

2.5.2 相似度評價 將金櫻子果實(shí)、果肉、果核色譜圖分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)行相似度分析(見表5)，結(jié)果顯示金櫻子果實(shí)與果肉的相似度較高，其次為果實(shí)與果核，果肉與果核相似度較低。

表5 金櫻子果實(shí)不同部位特征圖譜相似度結(jié)果

2.5.3 化學(xué)模式識別分析 運(yùn)用SPSS 20.0、Past 3.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和主成分分析，建立11批金櫻子不同部位的聚類分析(CA)樹狀圖和主成分分析(PCA)圖。

(1)聚類分析。11批金櫻子不同部位特征圖譜CA結(jié)果如圖5所示。由CA結(jié)果可知，可將11批金櫻子不同部位共33個樣本聚為三類，其中果實(shí)共聚為一類(Ⅱ類)，果肉共聚為一類(Ⅲ類)，果核共聚為一類(Ⅰ類)。由于不同批次間金櫻子果實(shí)存在一定差異性，導(dǎo)致聚類分析過程中有一批果實(shí)(S5)聚在了果核類別。金櫻子不同部位特征圖譜聚類分析結(jié)果表明，基本可將金櫻子果實(shí)、果肉、果核之間區(qū)分開。

圖5 金櫻子果實(shí)不同部位聚類分析(CA)樹狀圖

(2)主成分分析。11批金櫻子不同部位特征圖譜PCA結(jié)果如圖6所示，主成分1(PC1)、主成分2(PC2)的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到98.5%，表明所構(gòu)建的模型預(yù)測能力良好。繪制的二維得分散點(diǎn)圖顯示出可將11批金櫻子不同部位共33個樣本分為三類，果實(shí)、果肉、果核不同部位之間可完全分開。

圖6 金櫻子果實(shí)不同部位主成分分析(PCA)得分散點(diǎn)圖

3 討論

3.1 供試品制備方法考察

分別考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇4種提取溶劑對金櫻子特征圖譜的影響，結(jié)果表明，當(dāng)采用乙醇作為提取溶劑時，色譜峰數(shù)目較少，溶劑效應(yīng)影響大，而50%甲醇提取效率最高，色譜峰數(shù)目較多，溶劑效應(yīng)影響較小。同時考察了提取方式(加熱回流和超聲提取)和提取時間(15、30、45、60 min)，結(jié)果表明采用加熱回流提取效果明顯高于超聲提取，提取時間對提取效率影響不大，加熱回流提取30 min基本可提取完全，故供試品制備方法確定為加入50%甲醇，加熱回流提取30 min。

3.2 色譜條件優(yōu)化

通過對比不同的有機(jī)相(甲醇和乙腈)、不同的水相(水、0.05%磷酸、0.1%甲酸、0.1%乙酸)作為流動相的色譜圖，當(dāng)選取甲醇-0.05%磷酸溶液作為流動相時，色譜峰的信息較完整且分離度較好。故最終選定甲醇-0.05%磷酸系統(tǒng)作為流動相。為確定最佳檢測波長，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別于202 nm、254 nm、290 nm波長處測定。結(jié)果表明，檢測波長為202 nm時，各特征峰響應(yīng)值較大，基線平穩(wěn)，干擾較小，因此確定202 nm作為最佳檢測波長。

3.3 含量及特征圖譜結(jié)果討論

由金櫻子不同部位兒茶素含量結(jié)果可知，果實(shí)、果肉與果核之間兒茶素含量存在顯著性差異，果肉中兒茶素的含量高于果核5倍，計算11批果核與整個果實(shí)重量的比例，約為50%。研究表明[12-13]兒茶素味感主要表現(xiàn)為澀味，澀味強(qiáng)度隨兒茶素濃度增加而呈線性增強(qiáng)，因此，金櫻子澀味主要來源為果肉，與其澀精氣功效密切相關(guān)。以金櫻子果實(shí)UPLC特征圖譜標(biāo)定的13個共有特征峰為參照，在相同色譜條件下測定果肉與果核，結(jié)果顯示7、8、9號共有峰在果肉中能明顯檢測出而在果核中未能檢測出，6號共有峰在果核中能明顯檢測出而在果肉中未能檢測出。金櫻子果核兒茶素含量低，所占果實(shí)比例大，化學(xué)成分與果肉也存在明顯的差異，因此金櫻子臨床用藥去核使用具有一定意義，該用法是否與古籍文獻(xiàn)中所述的“其腹中之子，偏能滑精，煎膏不去子，全無(功)效也”(清·《新編》)藥效對應(yīng)，還有待進(jìn)一步深入研究。

3.4 化學(xué)模式識別分析

本實(shí)驗(yàn)在建立金櫻子果實(shí)不同部位UPLC特征圖譜的基礎(chǔ)上，結(jié)合化學(xué)模式識別方法進(jìn)行聚類分析和主成分分析，不同模式下均可將金櫻子果實(shí)、果肉、果核分別聚類而區(qū)分開，表明金櫻子果實(shí)中不同部位的整體化學(xué)成分是存在顯著差異的。本研究方法可用于金櫻子果實(shí)不同部位的鑒別，對于金櫻肉飲片質(zhì)量控制及臨床去核使用準(zhǔn)確用藥具有重要的指導(dǎo)意義。