響應面法優化銀葉金合歡組培苗生根培養基條件

武愛龍， 何 冰， 吳建陽， 周鮮嬌

(1.湛江幼兒師范專科學校， 廣東 湛江 524037； 2.嶺南師范學院 基礎教育學院， 廣東 湛江 524037；3.嶺南師范學院， 廣東 湛江 524048)

銀葉金合歡 (Acaciapodalyriifolia)是豆科金合歡屬植物，為常綠大型灌木或小喬木，耐干旱，具根瘤，在全日照、排水良好的環境能快速生長。其花期冬末春初，黃花色系，頭狀花序，腋生，開花時成簇，形成球狀花冠，是一種優良的冬季型觀花、觀葉及植被恢復、蜂源樹種[1]，因而被廣泛應用于城鄉園林綠地景觀多元化提質和風景林景觀生態建設中[2]。特別是在我國海南、福建、廣東、廣西等南方省區將銀葉金合歡作為行道樹和公園綠化樹種種植，具有適應性強、長勢良好、觀賞效果佳的特點，市場對銀葉金合歡種苗的需求量越來越大[3]，而目前優良的種苗主要依靠進口，價格較高[4]。銀葉金合歡種苗主要是以播種繁殖和扦插繁殖為主，但播種繁殖因其種子外部具有蠟狀角質層，常溫下透水性極差，自然狀況下發芽率極低；而扦插繁殖又因其單寧含量較高，插條不容易生根[5-7]。因此，利用組培技術快速繁殖培育優良銀葉金合歡種苗是重要發展途徑。外植體生根是組培苗培育的關鍵因素，根系的多少、強弱直接影響組培苗的成活率與繁殖效率。組培苗生根培養基的配置受多種因素的影響，僅注重某一因素優化生根培養基較為片面，不利于提高組培苗的生根能力。響應面法可在單因素試驗的前提下，通過對各因素與組培苗生根指標的相關性分析建立回歸模型，經計算可得到可靠的試驗因素優化方案[8-9]。筆者采用響應面法優化銀葉金合歡組培苗根系生長條件，以期能篩選出適合銀葉金合歡組培苗快速生長的生根培養基配方供繁育組培苗參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為組培室繼代保存的銀葉金合歡組培幼苗。從幼苗中選取生長健壯，高1.5 cm以上的芽，接種于生根培養基上。

1.2 試驗方法與條件

由于生根培養基主要受到培養基激素種類IBA、NAA以及蔗糖添加量的影響，所以前期通過單因素預試驗確定各試驗因素的范圍后，采用響應面分析法優化銀葉金合歡生根培養基，利用響應面法確定銀葉金合歡生根培養基的最佳條件。選用根數、生根率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken design 設計原理，在單因素基礎上選取IBA濃度(A)、NAA濃度(B)、蔗糖添加量(C)因素為自變量，選取根數(Y1)、生根率(Y2)因為變量，設計3因素3 水平試驗(表1)。再利用Design-Expert 8.0.6軟件中的RS(response surface)程序分析，應用Model Graph程序作響應面圖，獲得銀葉金合歡組培生根培養基最佳的激素濃度以及蔗糖添加量。

表1 銀葉金合歡生根培養基響應面試驗因素水平

以上試驗以1/2MS為基本培養基，添加瓊脂6 g/L，活性炭0.05 g/L，控制pH為6.0，生根培養基均在121℃蒸汽高壓滅菌15 min，室內培養溫度為26℃，光周期為14 h、光照強度1 500～2 000 lx。每組試驗接種10瓶，每瓶10株，3次重復，20 d后調查統計其生根率、生根數。

1.3 數據統計與分析

1.3.1 數據統計

生根率=生根的組培苗數/全部的組培苗數(接種苗數)×100%

每株平均生根數=生根苗的總根數/總生根株數

1.3.2 數據分析與最優驗證 利用Design Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行響應面曲線優化分析，由回歸方程得到IBA濃度、NAA濃度、蔗糖添加量這3個因素對銀葉金合歡生根影響的響應曲面。該圖直觀的給出了各因素相互作用響應面的 3D 圖，根據所擬合的響應面形狀，分析各因素對銀葉金合歡幼苗生根生長情況的影響，推測出最佳生根培養基的條件。

2 結果與分析

2.1 銀葉金合歡組培苗生根生長情況

組培苗芽接入生根培養基培養的第7天后，部分芽苗在切口處開始長出白色圓點；第10天后開始生根，幼根呈現放射狀排列，同時幼苗開始生長，葉片變綠；第20天時對生根情況調查發現，沒有根的苗基部會形成成塊疏松白色愈傷組織，或苗基部切口呈現褐色，而有根的苗根呈乳白色，較粗，部分有側須根。隨著培養時間的延續，生根苗葉片逐漸轉綠，根系逐漸伸長，苗也逐漸長高。

2.2 響應面(RSM)試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立與分析 以銀葉金合歡組培幼苗根數、生根率為響應值，利用 Design-Expert 8.0.6軟件進行二次多元回歸擬合，建立模型:

Y1=3.76+0.20A+0.21B+0.19C+0.27AB+0.27AC+0.065BC-0.70A2-0.49B2-0.40C2

Y2=71.51-0.68A+5.91B+4.56C+8.38AB+7.93AC+0.61BC-14.50A2-7.98B2-5.59C2

式中，Y1，Y2分別為銀葉金合歡組培幼苗的根數、生根率；A為IBA濃度；B為NAA濃度；C為蔗糖添加量。對回歸模型進行方差分析(表2)可知，以根數、生根率為響應值建立的回歸模型均極顯著(P<0.01)，說明建立的模型有意義；回歸模型的失擬項不顯著(P>0.05)，說明模型的擬合度良好。此外，對回歸方程進行檢驗，由方差分析結果可知，根數模型的校正決定系數RAdj2=0.967 9，說明該模型能夠解釋96.79%響應值的變化；生根率的RAdj2為0.859 7；說明以根數、生根率為響應值建立的模型與數據擬合度高，可以采用此回歸模型進行銀葉金合歡組培苗生根培養基的生根生長情況相關分析與預測。通過回歸系數顯著性檢驗(表2)可知，在根數作為響應值中，一次項系數A、B和C的P值均<0.01，表明線性影響效應中A、B和C對銀葉金合歡生根培養基的根數影響效應顯著，影響銀葉金合歡根數的因素主次為NAA濃度>IBA濃度>蔗糖添加量。二次項系數A2、B2、C2的P值均<0.000 1，說明多個具體的試驗因子對響應值的影響變化相對復雜，曲面效應極顯著，交互項AB、AC交互效應P<0.01，效應極顯著，BC交互效應不顯著。

表2 響應面二次多項式模型及回歸系數的方差分析

在生根率作為響應值中，一次項系數B(NAA)的P值為0.009 5,P<0.01和C(蔗糖添加量)的P值為0.029 3，P<0.05，表明線性影響效應中B(NAA濃度)和C(蔗糖添加量)對銀葉金合歡生根培養基的根數影響效應顯著，而A(IBA濃度)對銀葉金合歡生根培養基的根數影響效應不顯著，影響銀葉金合歡生根培養基根數的因素主次為NAA濃度>蔗糖添加量>IBA濃度。二次項系數A2、B2、C2的P值均<0.05，說明多個具體的試驗因子對響應值的影響變化相對復雜，曲面效應顯著，交互項 AB、AC交互效應P<0.05，效應極顯著，BC交互效應不顯著。

2.3.2 響應曲面的分析與優化 利用 Design-Expert 8.0.5求解回歸方程，以銀葉金合歡組培幼苗根數、生根率為指標，形成了響應曲面圖(圖1)，得到適合銀葉金合歡最佳生根培養基組合為1/2MS +IBA 0.80 mg/L+ NAA 0.30 mg/L+蔗糖15 g/L +活性炭0.05 g/L+瓊脂6 g/L ，此條件下銀葉金合歡幼苗根數3.756條，生根率71.506%。

3 結論與討論

試驗以銀葉金合歡增殖培養獲得的健壯無菌芽為材料，通過調整IBA、NAA、IAA 3種植物調節劑的濃度，篩選出適宜生根的培養基。利用響應面法，評分值作響應值，建立響應面模型，并對其回歸方程分析，獲得最優培養基條件中 3個因素的加入量為IBA 0.8 mg/L、NAA 0.3 mg/L、蔗糖15 g/L，此條件下銀葉金合歡幼苗根數3.756條，生根率71.506%。

研究在前人研究的基礎上，以銀葉金合歡組培幼苗根數、生根率為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件對中心組合設計所得試驗數據獲得回歸方程，并進行響應曲面法分析，能得到最佳的試驗結果，而且這樣的結果更具說服力，當然銀葉金合歡生根條件的影響因素很多，除研究中的3種因素外還有其他影響因素，如有機添加劑、不同的 pH等還有待進一步深入研究。