貴州發酵酸湯中攜帶真菌病毒的酵母菌篩選

張婷婷， 龍 慧， 滕 麗,3， 蔡小姚， 劉紅美*

(1.貴州醫科大學 生物與醫學工程重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 環境污染與疾病監控省部共建教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫科大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550025)

山西人酷愛陳醋的酸，江浙人善用紅醋的酸，而貴州人青睞發酵后的植物酸[1]。這種植物酸是貴州獨特的民間飲食酸湯。貴州酸湯文化形成與當地地形、氣候和經濟等不利因素的影響有關，人民的生活用品短缺尤其是食鹽的匱乏，加上氣候潮濕，流行腹瀉、痢疾等疾病[2]，貴州人們以酸代鹽的烹調方法，創造出了既適應當地的惡劣環境又清香適口有保健作用的多品種酸湯[3]。研究表明，酸湯中富含多種有機酸、礦物質和益生菌，有調節人體腸道微生態平衡、助消化、防止便秘、降低膽固醇以及調節人體生理機能等作用[4]。

酸湯中的益生菌主要菌群有乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等[5]。酵母菌是指主要以單細胞形式存在，以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖，有性生殖階段不產生子實體的真菌。酵母菌是單細胞真核生物，形態特征通常有橢圓形、球形、卵圓形、檸檬形或藕節形等[6]。大部分酵母菌的菌落特征和細菌相似，但比細菌菌落大而厚，菌落表面光滑、濕潤、粘稠，易挑起；質地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色均一；多為乳白色，少數為紅色，個別為黑色。酵母菌能在pH為3.0～7.5環境內生長，最適pH為4.5～5.0，最適生長溫度為20～30℃[7]。

酵母菌在大自然分布非常廣泛，在農業、醫藥、工業生產和科學研究中有較高應用價值[8]；如專用酵母菌種在動物營養領域的應用廣泛，如作為微生態制劑、著色劑、單細胞蛋白質、發酵飼料原料等[9]；另外，有些酵母菌可導致食物和飲料腐爛，還有些酵母菌是人體的條件致病菌，能感染皮膚和黏膜系統，并在人體免疫功能低下或免疫系統受損時，引起致命的擴散性深部感染，給人類健康帶來嚴重威脅[10]。如屬于念珠菌屬的白色假絲酵母菌是人類最常見的致病菌，感染后可引起皮膚黏膜念珠菌病、內臟念珠菌病及念珠菌血癥等[11]。

真菌病毒是一類可以浸染絲狀真菌、酵母和卵菌，并能在其中復制的病毒。1962年，HOLLINGS等[12]在英國通過電子顯微鏡在蘑菇栽培中發現了3種與疾病相關的球形或短桿狀病毒。1967年，ELLIS等[13]通過電子顯微鏡在匐枝青霉(P.stoloniferum)的培養液中也觀察到了病毒粒子。LAMPSON等[14]也發現繩狀青霉(Renicilliumfuniculosttm)中的 dsRNA病毒可誘導繩索青霉菌誘導干擾素。在已有的研究基礎上，BANKS等[15]進一步研究發現，匐枝青霉病毒(PenicilliumstoloniferumVirus；PsV)和繩狀青霉病毒(PenicilliumfuniculosumVirus；PfV)的基因組均為dsRNA。在已報道的真菌病毒中，大多數病毒為RNA病毒，只有少數是DNA病毒。RNA病毒根據其基因組類型分為雙鏈RNA病毒(double-stranded RNA dsRNA)和單鏈RNA病毒(ssRNA)。其中，絕大多數真菌病毒為dsRNA病毒，只有少數為ssRNA病毒。目前，真菌病毒主要分為14個科。其中，7個科為dsRNA病毒，5個科為ssRNA病毒，其余2個科為逆轉錄RNA病毒[16-19]。dsRNA病毒主要屬于6個科，分別是呼腸孤病毒科(Reoviridae)、全病毒科(Totiviridae)、雙分病毒科(Paritiviridae)、產黃青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分體病毒科(Quadriviridae)和巨型雙節段病毒科(Megabirnaviridae)。全病毒科有5個屬，分別是全病毒屬(Totivirus)、維多利亞屬(Victorivirus)、梨形鞭毛蟲病毒屬(Giardiavirus)、滴蟲病毒屬(Trichomonasvirus)和利什曼原蟲病毒屬(Leishmaniavirus)[20]。

酵母菌中攜帶有一類真菌病毒，屬于全病毒科(Totiviridae)全病毒屬(Totivirus)雙鏈RNA病毒。此類病毒含2條基因組片段，按片段大小分別命名為L-A病毒片段(large-size)和M衛星殺手病毒片段(medium-size)。有研究表明，攜帶這類病毒的酵母菌株，通過分泌殺手毒素(Killer toxins；KTs)，也稱為抗真菌蛋白(antifugal proteins)，消滅酵母菌株[21-22]。這類真菌病毒通過殺滅其他酵母菌株營造更多有利于自身的生存空間和資源，但同時也打破了原有的微生物動態平衡。因此，筆者通過篩選貴州發酵紅、白酸湯中的酵母菌，檢測其攜帶真菌病毒的攜帶率和多樣性，為下一步研究攜帶真菌病毒的酵母菌如何調節貴州發酵紅、白酸湯中微生物群落的動態平衡提供試驗材料，為揭秘發酵酸湯獨特口感提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 在貴州省都勻、仁懷、遵義和畢節地區用高壓滅菌的2 mL離心管，收集酸湯樣品，采集后保存于4℃冰箱，待分離。

1.1.2 試劑 YEPD固體培養基、頭孢(100 mg/mL)、50×TAE、2×GPS、10% SDS、氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)、苯酚、無水乙醇、洗脫緩沖液、1×STE、3 mol/L醋酸鈉(pH=5.2)、異丙醇、75%乙醇、DEPC-H2O、10×STE、1%(w/v)瓊脂糖凝膠等。

1.1.3 儀器與設備 電子天平、pH調節計、電熱鼓風干燥箱、立式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺、移液器、電磁爐、微波爐、冰箱、立式超低溫保存箱、瓊脂糖凝膠電泳儀電源、4℃離心機、反滲透超純水機、振蕩器等。

1.2 分離純化酵母菌

用移液槍吸取1 mL酸湯樣品、9 mL無菌水置于10 mL試管中，振蕩混勻，標記為10-1稀釋度，用1 mL移液槍吸取1 mL 10-1稀釋度的培養液于9 mL無菌水試管中，標記為10-2稀釋度，依次稀釋，共7個梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，用移液槍吸取100 μL菌液于YEPD固體培養基(含100 mg/mL頭孢)的平板上進行涂布，每個稀釋梯度平行涂布3個平板，28℃恒溫培養箱培養24 h。挑取YEPD固體培養基中不同形態、不同大小的菌落在YEPD固體培養基上進行劃線，在28℃恒溫培養箱中培養24 h，經多次劃線純化得到單一菌落。

1.3 PCR反應期電泳檢測

利用1.2方法提取的酵母菌DNA樣品2 μL為擴增模板，引物ITS12 μL，引物ITS42 μL，ddH2O 19 μL，混合物25 μL，總體積為50 μL；空白不加樣品，ddH2O改為21 μL，其余相同。擴增使用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR擴增程序：94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環。然后將5 μL PCR產物點樣至1%瓊脂糖凝膠(已加入染色液)的點樣孔中，電壓110 V，電流90 mA，時間約30 min。用凝膠成像儀觀察電泳結果，將合格的PCR反應產物送檢。

1.4 DNA和dsRNA的提取及純化

挑取培養的目標菌株，將菌絲體在液氮冷凍條件下用碾缽研磨成粉末狀，裝入無菌離心管中。每0.4 g樣品中依次加入600 μL 2×GPS、600 μL苯酚(Tris-HCl飽和，pH 8.0)、600 μL氯仿-異戊醇(體積比24∶1)和138 μL 10% SDS，劇烈振蕩，使之充分混勻，12 000 r/min、4℃離心10 min。然后取上清液約600 μL，加入0.04 g CF-11纖維素粉末和114 μL無水乙醇，混勻后4℃冰浴過夜。然后離心機12 000 r/min離心5 min后棄上清液，倒扣濾紙上吸干殘液，移液器加入600 μL清洗緩沖液，混勻后靜置1 min；重復洗脫3次后，加入640 μL 1×STE，混合搖勻，12 000 r/min離心8 min并吸取600 μL上清液至新的無菌離心管中，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉，加入1倍體積的異丙醇，充分混勻后于-20℃冰箱中靜置2 h，12 000 r/min、4℃離心30 min，去除上清液，加入500 μL 75%乙醇，振蕩無菌離心管，將沉淀彈起，清洗沉淀，12 000 r/min、4℃離心5 min后棄去上清液，用移液槍吸去管底的多余液體，風干沉淀10 min，加入20 μL DEPC-H2O，沉淀溶解完全得到菌株中的真菌病毒。樣品在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用0.1 μg/mL溴化乙錠染色，紫外下觀察各菌株攜帶真菌病毒的條帶特征。

1.5 菌種的保藏

挑取經過ITS鑒定的酵母菌菌株，放在YEPD液體培養基的試管中，28℃振蕩培養24 h。取0.5 mL培養的酵母菌液與0.5 mL的50 %無菌甘油以1∶1比例混合，標記菌種名稱和保存時間，放于-80℃低溫冰箱保藏。

2 結果與分析

2.1 采集的酸湯樣品

2.1.1 收集 試驗共收集了51份發酵酸湯樣品，其中都勻市(DY)采集7管，仁懷市(RH)采集7管，遵義市桐梓縣(TZ)采集9管，畢節市納雍縣(NY)采集26管(圖1)。由圖1可見，不同的發酵酸湯樣品顏色深淺不一。另外，不同發酵酸湯樣品的濃稠度也不同，這可能與發酵酸湯樣品的發酵時間以及含有微生物的多樣性不同有關。

2.1.2 樣品的pH 由表1可知，從畢節納雍縣(NY)采集的26管發酵酸湯pH平均值趨于5.5，從仁懷市(RH)、都勻市(DY)、遵義市桐梓縣(TZ)3地采集的發酵酸湯pH平均值趨于3.87。基于酵母菌能在pH為3.0～7.5內生長，最適pH為4.5～5.0，表明貴州發酵酸湯的酸度適合酵母菌株的生長繁殖。不同地區發酵酸湯pH不同，表明樣品中微生物的多樣性可能存在一定的差異。

表1 酸湯樣品pH

2.2 YEPD培養基上微生物菌落形態

如圖2所示，不同發酵酸湯樣品在YEPD培養基上生長出不同菌落形態的微生物，從菌落顏色看，主要為乳白色、奶白色、灰白色、粉紅色等；從菌落形狀看，主要為橢圓、圓形，部分為放射狀，菌落邊緣多整齊均一，菌落側面多為凸起、隆起或扁平，其表面多是光滑濕潤，少數是干燥粗糙；菌落質地多樣(緊實、松軟易挑起、粘稠)；打開培養皿常伴有淡淡的發酵酒香。另外，在一些培養皿中也有絲狀真菌和疑似細菌的菌落出現。

2.3 PCR擴增結果

從YEPD培養基上挑取疑似酵母形態的菌落，使用ITS1和ITS4引物擴增PCR后連接載體測序，最后篩選出47株酵母菌株(圖3)。其中，Sacchaomycescerevisiae有21株，Zygosaccharomycesbailii有9株，Pichiakudriavzevii有6株，Candidatropicalis有4株，Candidautilis有3株，Kazachstaniahumilis有2株，Galactomycessp和Candidaglabrata各1株。

2.4 DNA和dsRNA真菌病毒的檢測

由圖4可知，檢測樣品共47孔，粗提dsRNA攜帶病毒條帶的有37孔，攜帶率約79%；試驗菌株中，病毒RNA的攜帶率高，且條帶較多樣化，主要出現在1～5 kbp。

3 結論與討論

貴州發酵酸湯清涼解渴且風味獨特，其中的益生菌群及豐富的營養成分可調整人體腸道微生物生態平衡，增進人體健康及預防消化道疾病等，另外發酵酸湯也可作為地方特產進行產業化生產，促進貴州經濟的發展。雖然酸湯產業取得了一定的成績，但快速健康地發展仍面臨很多問題。酸湯產品在儲藏過程中，常容易發生腐敗變質，取代酸湯的清香變為氨臭，嚴重影響產品的感官品質[23]。

酵母菌屬于單細胞真菌，多存在于含糖量高、酸度大的水生環境中，如貴州發酵酸湯是其較好的生存環境之一。長久以來，酵母菌因為生長快、代謝旺盛、特殊代謝產物繁多等特點而在食品、酒精、醫藥、飲料等行業被廣泛應用，對酵母菌的資源研究和使用大大改善和豐富了人類的生活。此外，真菌病毒廣泛分布于各種真菌和卵菌類群中，其中對寄主菌具有弱毒能力的真菌病毒具有作為生防資源的利用價值；有一類真菌病毒可以通過分泌殺手毒素殺滅同種或不同種酵母菌株[24-26]。而貴州發酵酸湯中的酵母菌為研究真菌病毒提供了切實可行的研究對象。

值得注意的是，有的條件致病真菌在自然界或25℃培養時呈菌絲形態(即菌落呈毛樣)，而在組織中或在37℃培養時則呈酵母形態，這種因環境溫度不同菌落形態亦不同的真菌稱為雙相真菌[27-28]。因此，在試驗初期篩選酵母菌時，也要盡可能將非顯著酵母菌形態特征的菌株進行粗提dsRNA。雖增大了篩選工作量，但也增加了篩選到目標菌株的可能性。

試驗從貴州發酵酸湯中分離和鑒定出攜帶真菌病毒的酵母菌株，對攜帶真菌病毒的酵母調節貴州酸湯的微生物生態平衡研究既提供了大量目的菌株，也對后續研究真菌病毒的基因組序列及鑒定其病毒分類學分類地位起到重要作用。