芍黃顆粒對小鼠銀屑病模型的治療作用研究

程國強 董涵 王永金 夏介英 洪楊

摘要：為了探討芍黃顆粒對小鼠銀屑病模型的治療作用，采用咪喹莫特致小鼠銀屑病模型觀察芍黃顆粒對銀屑病模型小鼠皮損組織病理變化、表皮厚度及皮膚組織中增殖細胞核抗原（PCNA）表達的影響;采用小鼠陰道上皮病理模型及小鼠尾鱗片上皮病理模型觀察芍黃顆粒對小鼠陰道上皮有絲分裂及小鼠尾鱗片表皮顆粒層形成的影響。結果表明，與模型組比較，芍黃顆粒各劑量組均能顯著減小銀屑病模型小鼠皮膚厚度（P<0.05），芍黃顆粒5.0、10.0g/kg劑量對小鼠背部皮損有改善作用且能顯著減少小鼠皮膚組織中PCNA蛋白表達量;芍黃顆粒10.0g/kg劑量能明顯抑制小鼠陰道上皮細胞有絲分裂，對小鼠尾鱗片表皮顆粒層形成有顯著促進作用。表明芍黃顆?？赏ㄟ^影響表皮細胞過度增殖、角化不全而減小皮膚厚度、改善皮損，抑制陰道上皮細胞有絲分裂，促進小鼠尾鱗片表皮顆粒層形成等來治療銀屑病，為銀屑病治療的有效藥物。

關鍵詞：芍黃顆粒;銀屑病;動物模型

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）09-0137-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.029

銀屑病是一種常見的頑固性皮膚病，病程較長，易復發。該病發病以青壯年為主，對患者的身體健康和精神狀況影響較大川。臨床表現以紅斑、鱗屑為主，全身均可發病。有關該病的病因雖然進行過許多研究，但至今尚不十分清楚。目前認為，該病的發生不是單一的原因，可能涉及多方面，如遺傳、感染、內分泌因素、免疫異常等。該病目前尚無特效療法，適當的對癥治療可以控制癥狀。由于該病是一種慢性復發性疾病，不少患者需要長期醫治。西醫治療銀屑病主要有聯合療法、交替療法、序貫療法和間歇療法等，而各種療法都有一定的不良反應[2，3]。

祖國傳統醫學認為血熱是銀屑病發病的重要原因，風熱之邪結聚于皮膚，則局部的氣血運行失暢，氣血久郁則血熱，紅斑是血中有熱的表現，白屑是熱盛血燥、皮膚失養所致[4]。芍黃顆粒由赤芍、生地黃、牡丹皮、蒲公英、金銀花、白茅根組成，具有鎮痛鎮靜、抗炎抗潰瘍、解熱解痙、免疫調節等作用。本試驗采用咪喹莫特致小鼠銀屑病樣皮損模型、鼠尾鱗片顆粒層模型及小鼠陰道上皮病理模型，觀察芍黃顆粒對銀屑病的治療作用，為其臨床應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥品 芍黃顆粒由赤芍、生地黃、牡丹皮、蒲公英、金銀花、白茅根等組成，試驗用中藥材購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經四川省中醫藥科學院資源所專家鑒定為正品。藥物經水煎煮提取有效成分、濃縮，加一定比例輔料，烘箱低溫干燥制成棕黃色顆粒，1g相當于原生藥1.5g;噲喹莫特乳膏，四川明欣藥業有限責任公司;苯甲酸雌二醇注射液，天津金耀氨基酸有限公司;秋水仙堿，上海如吉生物科技發展有限公司;雷公藤多苷片，浙江得恩德制藥有限公司;復方青黛膠囊，陜西天寧制藥有限責任公司;小鼠增殖細胞核抗原（PCNA）抗體，Ab-cam（上海）貿易有限公司;Mouse E-Selectin ELISAKit、Mouse Endothelin 1（ET-1）ELISA Kit，CUSA-BIO BIOTECH CO.，LTD.。

1.1.2 試驗儀器 JA1003A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司;JY10001型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司;CX21型生物顯微鏡，廣州奧林巴斯工業有限公司;Varioskan Flash酶標儀，Thermo出品;BA200型Digital數碼三目攝像顯微攝像系統，麥克奧迪實業集團有限公司;Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統，美國Media Cybernetics。

1.1.3 試驗動物 SPF級昆明小鼠，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供。試驗動物生產許可證號：SCXK（川）2013-19。

1.1.4 試驗環境 四川省中醫藥科學院藥理毒理研究所SPF屏障系統，室內溫度20～22℃，相對濕度40%～70%，光照采用12h明亮、12h黑暗，合格證號為SYXK（川）2013-100。自由飲水。全營養顆粒飼料由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 芍黃顆粒對咪喹莫特致小鼠銀屑病模型的影響試驗取雌雄各半小鼠60只，將背部毛剃干凈，10只為正常對照組，其余小鼠均背部涂抹咪喹莫特乳膏，涂抹面積為2cm²，每天1次，每次約60mg，連續涂8d[5-7]。將制備好的咪喹莫特模型小鼠50只隨機分為5組，每組10只，分別為芍黃顆粒10.0、5.0、2.5g/kg劑量組、模型組和陽性藥物（雷公藤多苷片）組。共6組。芍黃顆粒組分別灌胃相應劑量藥物，陽性藥物組按0.1g/kg給予雷公藤多苷片，正常對照組與模型組小鼠給予等體積0.5% CMC-Na溶液，每天2次，連續14d;給藥期間除正常對照組外均隔日涂抹咪喹莫特乳膏。建模過程中觀察小鼠背部皮損變化情況。給藥結束后，剪取各組小鼠皮損皮膚，常規組織切片，經HE染色后觀察皮膚病理學變化，并測量表皮厚度;剪取各組小鼠皮損皮膚，石蠟包埋、切片經免疫組化處理觀察PCNA的表達水平。

1.2.2 芍黃顆粒對鼠尾鱗片顆粒層模型的影響試驗取小鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，每組10只，分別為正常對照組、芍黃顆粒10.0、5.0、2.5g/kg劑量組。芍黃顆粒組分別灌胃給予相應藥物，正常對照組給予等體積0.5%CMC-Na溶液，每天2次，連續14d。末次給藥1h后處死小鼠，在距尾根部約2cm處取尾背部皮膚一條，長約2cm，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。在光鏡下觀察鼠尾鱗片顆粒層形成情況，計數100個鱗片中有顆粒層的鱗片數[8]。

1.2.3 芍黃顆粒對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響試驗取雌性小鼠60只，10只為正常對照組，腹腔注射生理鹽水;其余50只腹腔注射苯甲酸雌二醇0.2mg/10g，每日1次，連續3d，使其處于雌激素期。第4天將處于雌激素期的小鼠隨機分為5組，每組10只，即模型組、陽性藥物（復方青黛膠囊）組、芍黃顆粒10.0、5.0、2.5g/kg劑量組。芍黃顆粒組分別灌胃給予相應藥物，陽性藥物組按1.0g/kg給予復方青黛膠囊，模型組與正常對照組給予等體積0.5%CMC-Na溶液，每日2次，連續5d。由于細胞有絲分裂的晝夜節律性，每組試驗時間應統一。第6天上午各組小鼠腹腔注射秋水仙堿2mg/kg，6h后處死小鼠，取陰道組織，常規組織切片處理，HE染色，光鏡下計數300個陰道上皮基底細胞的有絲分裂數[9，10]。

1.2.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計分析軟件，試驗數據均以平均數士標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 咪喹莫特致小鼠銀屑病樣動物模型皮損的外觀形態變化

與正常對照組比較，咪喹莫特模型組小鼠在涂抹咪喹莫特1～2d后皮膚即出現紅斑、鱗屑及增厚現象，皮損癥狀在7～8d最為嚴重，呈典型的銀屑病樣改變。隨著時間延長，模型組小鼠皮損日益嚴重，紅斑由少量淡粉色斑點變為大面積深紅偏棕褐色斑塊;鱗屑由瑣碎狀增多增厚，過渡至布滿裸露皮膚的層狀鱗屑;皮膚逐漸褶皺、隆起，增厚浸潤明顯。芍黃顆粒高、中、低劑量組和雷公藤多苷片組小鼠皮損癥狀與模型組比較有所減輕，鱗屑較少，紅斑量少且色淺，增厚浸潤程度較輕。

2.2 芍黃顆粒對銀屑病樣小鼠模型皮損的病理學變化及皮膚厚度的影響

由表1可知，與模型組比較，芍黃顆粒各劑量組均能顯著降低銀屑病模型小鼠的皮膚厚度（P<0.05）。

HE染色結果（圖1）顯示，正常對照組小鼠皮膚角質層、顆粒層、棘細胞層很薄;模型組小鼠皮膚過度角化、棘層增厚;芍黃顆粒能使小鼠皮膚角化過度減輕、棘層變薄，表皮層厚度明顯低于模型組。

2.3 芍黃顆粒對銀屑病小鼠PCNA表達水平的影響

由表2可見，與正常對照組比較，模型組小鼠皮膚組織中PCNA蛋白含量極顯著升高（P<0.01），提示造模成功。10.0和5.0g/kg芍黃顆粒組小鼠皮膚組織中PCNA蛋白含量極顯著降低（P<0.01）2.5g/kg芍黃顆粒組小鼠皮膚組織中PCNA蛋白含量與模型組比較無明顯差異。

圖2為光鏡下觀察PCNA陽性表達率情況。陽性物質呈棕黃色顆粒狀，正常對照組小鼠陰道上皮細胞中PCNA主要表達于基底層細胞，且著色較淺;與正常對照組比較，模型組PCNA的表達明顯增強，在基底層和部分棘層均有活躍表達，而且著色較深;10.0、5.0g/kg芍黃顆粒與0.1g/kg雷公藤多苷片可明顯抑制PCNA的表達。

2.4 芍黃顆粒對鼠尾鱗片顆粒層模型的影響

由表3可見，與正常對照組比較，10.0g/kg芍黃顆粒組鼠尾有顆粒層的鱗片數極顯著升高（P<0.01）。

2.5 芍黃顆粒對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響

由表4可見，與模型組比較，10.0g/kg芍黃顆粒組小鼠陰道上皮有絲分裂指數顯著降低（P<0.05）。

3 小結與討論

咪喹莫特為Toll樣受體激動藥，其與表皮漿細胞樣樹突狀細胞及巨噬細胞內的TLR7結合，分泌大量的干擾素α以及多種白細胞介素致動物表皮角化過度、角化不全、棘層肥厚、血管生成和炎細胞浸潤等人類銀屑病的組織病理學改變[11]。

雌激素期的小鼠陰道上皮細胞增殖活躍，基底層有絲分裂增加，上皮細胞轉換加快，可模擬銀屑病表皮增殖加速的特點，以評價藥物抑制細胞有絲分裂的作用，藥物如能抑制小鼠陰道上皮基底細胞的有絲分裂，說明其可能抑制銀屑病表皮的增生，從而具有改善作用。正常情況下，小鼠尾部鱗片的表皮角質層角質形成細胞保留有細胞核，而顆粒層細胞缺失，其天然的角化形式與人類銀屑病表皮相似，可以模擬銀屑病角化不全的特點，藥物如果能促進鼠尾鱗片表皮生成顆粒層，則說明其可能改變銀屑病表皮的角化不全，從而具有改善作用。以上3種模型被作為篩選抗銀屑病藥物的常用模型[12-14]。

本試驗選用上述3種常用模型評價芍黃顆粒對銀屑病的藥效學作用。結果表明，不同劑量芍黃顆粒均能降低銀屑病模型小鼠的皮膚厚度，使小鼠皮膚角化過度程度減輕、棘層變薄，表皮層厚度明顯低于模型組。高劑量芍黃顆粒能使鼠尾有顆粒層的鱗片數明顯增多，促進鼠尾鱗片表皮生成顆粒層，說明其可能改變銀屑病表皮的角化不全。增殖細胞核抗原（PCNA）與細胞DNA合成關系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態良好的指標，用PCNA標記可從分子水平反映上皮細胞增殖程度的變化。在正常表皮細胞中，PCNA表達水平較低，而在銀屑病中由于表皮基底細胞增生加速，PCNA表達明顯增強。本試驗結果顯示，中、高劑量芍黃顆粒能顯著抑制銀屑病模型小鼠皮膚組織中PCNA蛋白表達量，與謝青等[15]研究結果一致。同時，高劑量芍黃顆粒使小鼠陰道上皮細胞有絲分裂指數明顯降低，可抑制小鼠陰道上皮基底細胞的有絲分裂，說明其可能抑制銀屑病表皮的增生，從而具有改善銀屑病作用，這也與芍黃顆粒抑制銀屑病模型小鼠皮膚組織中PCNA蛋白表達量結果一致。綜上可知，芍黃顆粒對銀屑病癥狀有很好的改善作用，其作用機制有待進一步研究。

參考文獻：

[1]PREY S，PAUL C，BRONSARD V，et al.Cardiovascular risk factorsin patients with plaque psoriasis：A systematic review ofepidemiological studies[J].J For Acad Dermatol Venereol，2010，24（Suppl 2）：23-30.

[2]BREMMER S，VAN VOORHEES A S，HSU S，et al.Obesity andpsoriasis：From the medical board of the national psoriasisfoundation[J].J Am Acad Dermatol，2010，63（6）：1058-1069.

[3]張建中.銀屑病的流行病學與危險因素[J].實用醫院臨床雜志，2013，10（1）：4-6.

[4]王媛中，黃旦.中醫藥治療銀屑病研究進展[J].吉林中醫藥，2015，35（8）：861-864.

[5]韓珊珊，李輝，黨翔吉，等.銀屑片治療小鼠銀屑病的實驗研究[J].中成藥，2014，36（12）：2463-2466.

[6]王萍，聶繼紅，孫玉華.雙黃解毒乳膏對銀屑病動物模型作用的實驗研究[J].中成藥，2011，33（7）：1227-1229.

[7]底婷婷，趙京霞，王燕，等.涼血活血膠囊對咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣皮損的干預作用[J].中國病理生理雜志，2012，28（4）：718-722.

[8]黨翔吉，張鎮，魏立明，等.復方桅子凝膠對銀屑病動物模型的干預作用[J].中藥藥理與臨床，2013，29（5）：128-131.

[9]施惠娟，周茹，金少舉，等_氧化苦參堿對銀屑病模型雌激素周期小鼠陰道上皮細胞增殖和凋亡的影響[J].臨床皮膚科雜志，2011，40（11）：669-671.

[10]劉海杰，史新明，歐陽恒，等.仙方消銀片對模擬銀屑病模型小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響[J].中國中西醫結合外科雜志，2006，12（5）：488-490.

[11]賴奇偉.咪喹莫特誘發銀屑病的機制研究新進展[J].中國當代醫藥，2013，20（20）：25-27.

[12]閆玉紅，趙瑞芝，盧傳堅.銀屑靈片處方優化的實驗研究[J].時珍國醫國藥，2014，25（11）：2673-2675.

[13]韓珊珊，郭菲，劉紅霞.銀屑病模型與脾虛銀屑病病癥結合模型相關指標的差異[J].新疆醫科大學學報，2012，35（4）：416-419.

[14]熱比姑麗.伊斯拉木，阿瓦姑力.伊斯拉木，斯拉甫.艾白.銀屑病動物模型研究概況[J].中國藥房，2015，26（19）：2726-2729.

[15]謝青，王進，王菊英，等.依托泊苷對雌激素周期小鼠陰道上皮細胞PCNA表達的影響[J].中國生化藥物雜志，2009，30（1）：21-24.

收稿日期：2019-07-09

基金項目：四川省省級公益性科研院所基本科研業務專項（A-2018N-24）;四川省中醫藥管理局中醫藥科學技術研究專項（2018QN041）

作者簡介：程國強（1984-），男，河南課河人，助理研究員，主要從事中藥藥理、實驗動物模型研究，（電話）028-85247897（電子信箱cheng-gq110@163.com;通信作者，洪楊（1986-），女，四川成都人，助理研究員，主要從事動物營養學研究，（電話）18384125659（電子信箱）452663212@qq.com。