液相色譜-高分辨質譜測定貝類中軟骨藻酸

吳祥慶 余燾 吳明媛 黃國秋 楊姝麗

摘要：軟骨藻酸（DA）是一種由擬菱形藻屬硅藻產生的神經毒素，可累積在貝類體內，食用受軟骨藻酸污染的貝類產品可引起記憶喪失、眩暈、昏迷甚至死亡等癥狀。研究建立了貝類產品中軟骨藻酸的液相色譜-高分辮質譜檢測方法。以牡蠣和文蛤為研究對象，樣品經甲醇提取、采用QuEChERS凈化，經Hypersil GOLD C₁₈色譜柱分離，乙腈和2mmol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）為流動相梯度洗脫，正離子全掃描+數據依賴二級掃描，提取一級譜圖中準分子離子精確質量數定量，二級質譜圖中特征離子精確質量數定性。結果表明，軟骨藻酸在6min內出峰，定量限0.01mg/kg，在25～500μg/L線性良好，R²=0.9998，回收率為90.5%～106.3%，相對標準偏差（RSD）小于6.0%（n=6）。該方法簡單、快速、靈敏度高，能滿足貝類中軟骨藻酸的剛定。

關鍵詞：貝類;軟骨藻酸;高分辨質譜

中圖分類號：O657.6 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）09-0159-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.034

軟骨藻酸（Domoic acid，DA）是一種興奮性神經毒素。軟骨藻酸由硅藻門的擬菱形藻屬和菱形藻屬產生，1958年首次從日本鹿兒島縣的大型藻類樹枝軟骨藻中分離出。貝類可富集藻類產生軟骨藻酸，具有較強的耐受力。而軟骨藻酸經食物鏈富集后，可引起哺乳動物較嚴重的中樞神經損害。軟骨藻酸具有熱穩定性，一般的烹飪過程并不能破壞軟骨藻酸的毒性。人們食用含軟骨藻酸的貝類，可引起記憶喪失、眩暈、昏迷甚至死亡等癥狀。根據中毒癥狀，軟骨藻酸也被命名為失憶性貝毒。由軟骨藻酸引起的中毒沒有較好的療法，無法完全恢復受損的海馬結構或空間記憶能力。1987年加拿大愛德華王子島東海岸發生因食用軟骨藻酸污染的紫貽貝中毒事件，造成3人死亡，100多人中毒，其中12人病愈后記憶喪失長達18個月。研究發現，貝類中軟骨藻酸含量達到40mg/kg可引起中毒，150mg/kg時有致命危險。產毒藻擬菱形藻廣泛分布于全球海水中，中國沿海也有報道，對貝類產品食用安全的威脅不容忽視[1-5]。

檢測貝類中軟骨藻酸的方法主要有小鼠生物法、毛細管電泳法、薄層色譜法、液相色譜法等[6-10]。其中液相色譜法應用最廣，但是背景干擾大、靈敏度較低、選擇性不高。液相色譜一質譜聯用法具有高選擇性和高靈敏度的優點[11-16]，本研究采用液相色譜-高分辨質譜對貝類中軟骨藻酸進行檢測，能夠獲得目標物的一級、二級精確質量數質譜圖，具有很好的定性分析和定量檢測效果。由于貝類樣品基質復雜，本研究采用QuEChERS技術對提取液進行凈化，降低了基質效應，提高了樣品分析效率，為軟骨藻酸的監測提供了技術支持，為貝類產品食用安全提供了可靠保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

U3000液相色譜，美國賽默飛世爾公司Q Exae-live四極桿一靜電場軌道阱高分辨質譜儀，美國賽默飛世爾公司;HM100均質器，北京格瑞德曼公司;Centrifuge 58048離心機，德國艾本德公司;旋渦混合器，美國Talboys公司;Synergy純水儀，美國密理博公司。

標準品DA（103.4±3.4μg/mL）、CRM-DSP-Mus購自加拿大海洋生物科學研究所;甲醇、乙睛，色譜純，美國賽默飛世爾公司;甲酸，色譜純，美國Sigma公司;試驗用水由純水儀制備：C₁₈、GCB、PSA、MgSO₄基質分散固相萃取填料，購自上海安譜公司。

貝類產品為近江牡蠣、文蛤，采自欽州七十二涇、大風江貝類養殖區，實驗室-18℃保存。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件 Hypersil GOLD C₁₈色譜柱（1.9μm，2.1mm×100mm）。流動相：乙腈（A），2mmol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）（B）。梯度洗脫：0～1min，30% A：1～3min 30%A～50% A：3～4min 50%A：4.1～6min 30% A。流速0.2mL/min，進樣體積5μL，柱溫40℃。

1.2.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI）;掃描方式為正離子，一級全掃描+數據依賴二級掃描;噴霧電壓3200V;鞘氣流量40Arb;輔助氣流量10Arb;離子傳輸管溫度320℃;一級掃描分辨率70000;二級掃描分辨率17500，歸一化碰撞能量20、40、60eV。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 用清水洗凈貝類外殼，切斷閉殼肌，打開外殼，用純水沖洗泥沙等異物，取除外殼的全部肌肉和內臟作為試樣，瀝干后均質。

1.3.2 樣品提取、凈化準確稱取2.00g（精確到0.01g）樣品于50mL離心管中，加入9mL甲醇，渦旋混勻0.5min，超聲提取10min，8000r/min離心10min，將上清液轉移至另一離心管中，殘渣再用9mL甲醇重復提取1次，離心后合并上清液，加甲醇至20mL。加入1g MgSO₄、150mg C₁₈、150mg GCB，漩渦混合0.5min，8000r/min離心5min，取10mL上清液于50℃下氮吹至近干，用80%甲醇定容至1mL，漩渦混合0.5min，過0.22μm濾膜，待儀器分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

軟骨藻酸分子式為C₁₅H₂₁NO₆，選擇正離子模式下強度最高的[M+H]⁺作為定量離子，精確質量數理論值為312.14416。當[M+H]⁺強度達到8×10⁴則觸發二級掃描，軟骨藻酸強度最高的二級碎片離子為[M-HCOOH+H]⁺，精確質量數為266.13868，實際測定值為266.13836，偏差0.0012‰，二級質譜見圖1。通過高分辨質譜獲得母離子和子離子識別點分別為2IN和2.5IPs，因此只需要獲得1個母離子和1個子離子，就能滿足對目標化合物4個識別點的確證要求。

提取一級全掃描譜圖中[M+H]⁺的精確質量數312.14416定量，二級質譜中碎片離子[M-HCOOH+H]⁺定性。在相同儀器條件下，樣品與標準物質保留時間相對偏差在士5%以內，且檢測到[M+H]⁺、[M-HCOOH+H]⁺的精確質量數與理論值相對偏差小于0.005‰，可確定為軟骨藻酸陽性樣品。

2.2 色譜條件的選擇

研究選用C₁₈色譜柱，用乙腈和2mmol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）進行梯度洗脫，在“1.2.1”的色譜條件下，軟骨藻酸在6min內出峰，分析時間短，峰形尖銳，靈敏度高（圖2）。

2.3 樣品提取、凈化條件的優化

2.3.1 樣品提取條件的優化本研究根據軟骨藻酸的性質及相關文獻資料[17-19]，通過比較提取前、后加標的回收率，考察了用甲醇、50%甲醇、水的提取率。結果表明，3種提取劑的提取率均能達到90%以上。由于甲醇提取液有利于QuEChERS凈化及后續濃縮，因此本研究采用甲醇作為提取劑。

2.3.2 樣品凈化條件的優化 貝類樣品中含有大量脂肪、蛋白質和色素，基質效應大且易污染質譜，需要對提取液進行凈化。QuEChERS是一種分散固相萃取技術，將固相萃取吸附劑顆粒分散在樣品萃取液中，利用吸附劑與基質相互作用，吸附雜質達到凈化目的，廣泛應用于藥物殘留檢測[20，21]。本研究通過在基質提取液中加入標準溶液后，再添加不同固相萃取吸附劑凈化，比較了C₁₈、GCB、PSA3種常用凈化劑的效果。由于軟骨藻酸是酸性物質，PSA為堿性吸附劑，對軟骨藻酸吸附強，因此回收率較低。單獨使用C₁₈固相萃取劑對色素凈化效果一般;添加GCB后色素凈化效果較好，回收率在80%以上。最終確定2g樣品中加入150mg C₁₈、150mg GCB和1g MgSO₄。

2.4 線性范圍和檢出限

為減少凈化不完全帶來的基質效應，本研究使用基質標準曲線進行定量。取空白基質樣品，按“1.3.1”樣品處理方法制得基質溶液，在基質溶液中加入標準品配成濃度為25、50、100、250、500μg/L的基質標準溶液，按照“1.2”儀器條件上機測定。以被測組分的峰面積響應值為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸。在25～500μg/L線性良好，R²為0.9998。按照母離子信噪比（S/N）=3、信噪比（S/N）=10確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。DA檢出限為0.003mg/kg，定量限為0.01mg/kg，該方法完全可以滿足貝類毒素日常檢測的需要。

2.5 準確度和精密度

歐盟第853/2004號法規規定軟骨藻酸總安全限量值為20mg/kg。對存在最高殘留限量（MRL）的物質，加標回收試驗一般選擇定量限（LOQ）、MRL和2MRL 3個濃度水平進行。本研究選擇未檢出軟骨藻酸的牡蠣和文蛤樣品作為基質空白樣品，分別添加0.01、20、40mg/kg 3個濃度水平進行加標回收試驗。每個濃度水平做6個平行樣，結果見表1。結果表明，該方法的回收率和重現性較好。

3 結論

通過QuEChERS技術結合液相色譜一高分辨質譜，能夠有效凈化貝類樣品基質中的各種雜質，快速測定貝類產品中軟骨藻酸毒素。該方法簡單快速，靈敏度高，線性良好，回收率、精密度均能滿足貝類產品中軟骨藻酸毒素的限量要求。

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收稿日期：2020-02-18

基金項目：廣西重點研發計劃項目（桂科AB16380290）

作者簡介：吳祥慶（1977-），男，廣西玉林人，副研究員，主要從事水產品檢測技術研究工作，（電話）13878602255（電子信箱）wuxiangqing19@163.com;通信作者，楊妹麗，高級工程師，碩士，主要從事水產品檢測技術研究工作，（電話）13878178627（電子信箱）13878178627@qq.com。