基于生物活性與效應基準的中藥質量評價技術發展現狀與展望

張萌　封亮　賈曉斌

摘要 中藥質量的評控問題是制約中藥現代化發展的瓶頸，因此有必要在現有檢測方法的基礎上結合生物評價，繼而更為全面地保證中藥質量。生物評價是完善中藥質量標準、保證臨床功效和安全性評價的重要方法，已成為中藥質量標準化發展趨勢之一。在此處主要論述了近年來基于生物活性與效應基準的中藥質量評價技術和已取得的部分研究進展，同時對目前中藥質量生物評價研究與應用中存在的主要問題進行探討，進一步對其未來應用做出展望，從而更好的對中藥質量進行控制。

關鍵詞 中藥;生物活性;效應基準;質量評價技術;發展現狀;展望

Development Status and Prospect of Traditional Chinese Medicine Quality Evaluation Technology Based on Biological Activity and Efficacy Benchmark

ZHANG Meng，FENG Liang，JIA Xiaobin

（School of Traditional Chinese Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

Abstract The evaluation and control of the quality of traditional Chinese medicine（TCM）is the bottleneck that restricts the development of modernization of TCM.Therefore，it is necessary to combine the biological evaluation with the existing detection methods to ensure the quality of TCM more comprehensively.Biological evaluation is an important method to improve the quality standard，and ensure the clinical efficacy and safety evaluation of TCM，which has become one of the development trends of quality standardization of TCM.This paper mainly discusses the quality evaluation technology of TCM based on biological activity and effect benchmarks in recent years and some of the research progress that has been made.Meanwhile，it discusses the main problems existing in the current biological evaluation of TCM quality and its application，and further its future application，making an outlook to better control the quality，so as to better control the quality of TCM.

Keywords Traditional Chinese medicine; Biological activity; Efficacy benchmark; Quality evaluation technique; Development status; Prospect

中圖分類號：R285;R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.15.007

中藥質量是中藥發揮臨床療效的保障，對于中藥質量的控制與評價研究一直是推動中藥現代化進程中的重點和難點[1]。中藥多組分、多靶點、多途徑的特點決定了其物質基礎和作用機制的復雜性。隨著現代分析技術的飛速發展以及各學科交叉的融合創新，中藥質量評價研究有了全方位的進步，經歷了從形態鑒別到化學成分定性及定量檢測再到全過程動態控制，從單個指標的含量測定到基于指紋圖譜的多指標同時測定，從基于對照品的含量測定到一測多評等變化，從整體上對中藥質量評價水平進行了提升[2]。然而，僅基于化學基準的中藥質量控制模式存在指標性成分難以全面地反映整體質量、與臨床有效性及安全性關聯不夠緊密、不能充分體現中醫藥特色等問題，仍存在較大的局限性。因此，有學者提出構建“中藥品質標準評控力金字塔”，在基于化學基準的基礎上增加效應基準，逐步建立以生物評價為核心手段和指標之一的中藥質量標準體系，這將是中藥質量標準化建設的重要發展方向[3]。基于化學基準的中藥質量評價重在檢驗藥材的“真偽”，而基于生物活性與效應基準的中藥質量評價重在把關藥材的“優劣”。生物評價以理化分析和常規檢定為物質化前提，常規檢定以生物評價為效應性判定，兩者應是相輔相成、互為補充[4]，共同完善中藥質量評價體系。見圖1。

生物評價技術是以藥物的生物效應為基礎，利用整體動物、離體組織、器官、微生物和細胞以及相關生物因子等為試驗系，評價藥物有效性或毒性的方法，是繼性狀評價、化學評價之后，推動中藥質量標準走進臨床、關聯療效的關鍵舉措[4]。2006年肖小河研究團隊首次提出將生物評價作為中藥質量評價的重要內容[5]，構建基于道地藥材和生物評價的中藥質量評價模式，促進了中藥質量生物評價的蓬勃發展。繼2010版《中華人民共和國藥典》一部[6]收錄“中藥生物活性測定指導原則”后，2015版《中華人民共和國藥典》[7]增添了“基于基因芯片的藥物評價技術與方法指導”和“中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則”，2020版《中華人民共和國藥典》又增加了“DNA測序技術指導原則”和“標準核酸序列建立指導原則”[8]。美國FDA也于2015年發布《植物藥開發指南（草案）》[9]，明確指出與臨床療效相關的生物檢測方法是植物藥質量控制手段的發展方向，預示著生物測定必將成為中藥質量評價體系中的重要指標之一。

目前中藥質量生物評價技術大體可分為2大類：1）基于遺傳信息的中藥基原DNA分子鑒定，如隨機擴增多態性DNA（RAPD）、DNA條形碼等，主要用于中藥基原的鑒定;2）基于生物效應的中藥生物活性測定，主要用于中藥質量的有效性和安全性評價[4]。近年來，隨著生物檢測技術的發展，現代生物評價方法也有了新的手段，相繼出現了熱活性指紋圖譜（Thermal Activity Fingerprint）、細胞指紋圖譜（Cell Fingerprint）、生物自顯影薄層色譜（Bioautography TLC）、高內涵分析（High Content Analysis）、生物芯片（Biochip）等生物效應表達譜檢測方法，能夠同時滿足對中藥的定性鑒別與定量評價，在中藥質量一致性評價中具有優勢。生物標志物（Bio-marker）是標記系統、器官、組織、細胞及亞細胞結構或功能的改變或可能發生改變的生物學或生物化學指標[10]。用于中藥質量控制的生物標志物（Q-Bio-marker）是能夠反映中藥臨床功效或藥理作用的生物活性指標，可以將生物效應進行量化，關聯中藥的有效性、安全性和一致性[11]，理論上可用于大多數中藥的質量評價，特別適合用于化學成分及藥效作用機制不清楚且缺乏定量藥效評價指標的中藥[12]，包括生物活性值或效價（Biopotency）、生物活性標志物（Biomarker）、生物效應表達譜（Biological Fingerprint）等。除此之外，中藥質量生物評價方法還包括效應成分指數（Effective Components Index，ECI）、效應當量（Efficacy Equivalent，EE）、道地指數（Dao-di Index，DDI）等綜合性指標。基于生物活性與效應基準的中藥質量評價技術特點與適用范圍。見表1。

1 中藥生物活性測定技術

生物活性測定與中藥臨床療效和安全性的關聯性較為緊密，是反映臨床功效的基本方法之一。其以藥物的生物效應為基礎，以生物統計學為工具，結合中藥及其制劑的主治功能或不良反應，通過比較對照品和供試品對生物體或離體器官與組織、生物標記物等特定的生物效應，從而評價和控制中藥整體的質量和活性。測定技術包括生物效價測定法、生物活性限值和毒價測定[13]。其中，生物效價與生物活性限值的區別在于前者在一定劑量范圍內的量效關系明顯，而后者往往在達到某一特定值（如給藥量）后，才表現出某效應，如出現死亡、驚厥等，屬于半定量或定性范疇。

1.1 生物效價測定技術 生物效價可以較好地反映中藥產品的整體活性，并關聯中藥功效，適用于化學物質基礎不明確、常規理化方法難以評價其質量或不能反映其臨床生物活性的中藥及其制劑[11]。通過選擇直接關聯功效的生物效價分析方法能很好彌補化學評價方法的不足，為中藥的整體質量評價提供新的研究思路。曹喆等[14]以麻黃“發汗散寒”的功效為基礎，建立大鼠發汗藥理模型，以大鼠發汗量為檢測指標，測定不同產地麻黃對大鼠足后跖發汗斑點數的影響，結果表明，不同產地麻黃發汗效價與麻黃堿、偽麻黃堿總量之間的相關性不顯著，提示麻黃中可能還含有更強的具有發汗作用的化學物質或麻黃發汗作用是多種成分協同作用的結果，為麻黃質量評價研究提供新的研究思路。將生物評價方法引入動物類中藥的質量評控中，盡可能多地反映其功能主治，可彌補動物類中藥質量控制缺陷的現狀[15]。例如，對于清熱解毒類動物藥，如麝香、水牛角等，可采用抗菌、抗炎及解熱作用評價其清熱解毒功效，在此基礎上建立了酶免疫法、微量熱法等生物評價方法，有效地提高了質量控制水平。對于滋陰補血類動物藥，如阿膠、冬蟲夏草等，可利用吞噬細胞等免疫學功能的改變、構造生物衰老模型等來評價其免疫調節、增強造血及抗衰老的療效，直接反映其滋陰補血之功效，類似的還有活血化瘀類及壯陽益腎類動物藥等。Zhang等[16]綜合分析了不同產地三七的化學標志物（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd）、生物效價（抗凝活性）和生態因素（經度、緯度、海拔等）來評價三七的質量，利用這些參數可以有效地區分來自不同產地的三七，由此建立了可靠的質量評估體系。在中藥成方制劑方面，曹波等[17]利用基于體外抗血小板聚集的生物效價檢測方法，以小金丸臨床活血化瘀功效為出發點，評價其質量的一致性，并篩選出地龍、五靈脂和木鱉子可能是小金丸組方中發揮活血作用的關鍵中藥。

1.2 生物活性限值測定技術 生物活性的存在是實現藥效作用的前提和基礎，未能建立生物效價測定的中藥可采用生物活性限值測定法，生物活性限值是一種定性或半定量的評價方法，可采用中藥成分或化學藥品作為方法可靠性驗證用對照品[13]。高天紅等[18]建立紅花注射液的生物活性限值測定方法，以綜合評價其產品質量。使用膠原-腎上腺素誘導小鼠急性腦血栓模型，以紅花注射液對小鼠的偏癱保護率作為指標，考察紅花注射液的抗血栓生物活性。結果表明使用5.0 g生藥/kg的紅花注射液連續3 d腹腔注射給藥，對膠原-腎上腺素誘導小鼠急性腦血栓具有明顯的保護作用，同時建立的生物活性限值方法重復性、中間精密度、實驗室間重現性良好，因此建議以5.0 g生藥/kg劑量作為紅花注射液生物活性工藝優化和產品質量控制的限值。Li等[19]構建了一種生物測定方法評估何首烏的抗血小板聚集作用，并結合化學方法鑒定了抗血小板聚集標志物，可將樣品質量與中藥臨床療效相關的潛在化學標志物相關聯。周雪等[20]以天麻超微粉對小鼠自發活動的影響，以及其對小鼠戊巴比妥鈉誘導睡眠時間的影響為考察指標，研究了天麻超微粉鎮靜催眠作用的生物活性限制測定方法，該法可作為天麻超微粉的生物活性質量標準，能有效配合傳統檢驗方法對天麻微粉化制劑進行質量監控。

1.3 生物毒價測定技術 中藥毒性具有現代生物技術難以檢測的微小毒性、綜合毒性等特點，是中藥安全性評價的關鍵問題之一。如何準確、快速、高效地評價中藥的毒性，是中藥毒性研究的重要方向[21]。化學毒性評價存在一定的問題，如部分成分不能完全代表有毒中藥的整體毒性，成分之和簡單相加缺乏依據等。而生物毒價可直接反映中藥產品的毒性，與生物效價檢測方法相似，是一種關聯臨床、客觀準確、快速經濟的評價方法，可用于中藥的安全性評價。以毒價作為統一的毒性標示對藥材生產、加工、炮制等環節質量進行序貫控制，可輔助醫生在臨床上根據標示毒價調整劑量，確保用藥安全[4]。例如中藥附子具有回陽救逆、補火助陽的功效，而附子所含的多種強心成分具有較強的心臟毒性，可從生物活性層面對附子進行質量控制。劉蕾等[22]利用生物活性限制測定方法，以附子抑制心肌細胞活力的效應作為生物活性評價指標，研究了不同來源附子水提物對大鼠心肌細胞H9c2毒性的影響，探討其毒性劑量限值及其檢測限。結果確定了15.6 μg/mL可作為限值劑量，在該限值濃度下對大鼠心肌H9c2細胞活力抑制率為20%～24%，可作為質量合格的標準。趙志浩等[23]通過測定附子引起的大鼠室性早搏的最小中毒量，建立了附子毒性成分指數，作為附子炮制品減毒程度和質量評價的重要參考指標，評價了生附片、黑順片、白附片、蒸附片、炮天雄、刨附片的生物毒性，該方法具有快速、準確、經濟易行的技術優勢，還可用于不同商品等級的黑順片、附子配方顆粒、含附子的注射劑以及川烏、草烏等的質量評價，為毒性中藥的質量評控與臨床應用提供了新的思路與方法。華樺等[21]利用Microtox技術測定金銀花醇提物、山銀花醇提物對發光菌發光強度抑制率，計算發光細菌半數抑制濃度（IC50），來評價金銀花、山銀花提取物的毒性，與小鼠急性毒性試驗比較，該法快速、簡單、靈敏度高，可為全面評價中藥安全性提供參考。

生物活性測定法能更為直接地表征中藥的生物活性，但也存在一定的局限性。鑒于生物效毒價檢測多為離體細胞、組織、器官的定量藥理反應，且是基于某一特定藥理條件下的活性測定結果，尚不能完全反映中藥在疾病狀態下的治療作用[3]。采用生物限值法用于中藥生物活性質量控制，需在實驗系統穩定的情況下進行評價，這也是其在生物活性方面對中藥進行質控的局限[22]。理論上，實驗方法學考察的變異系數越小越好，但是生物效價檢測方法存在一定的因生物個體差異而引起的誤差，因此準確度、專屬性和精密度等較低，與化學分析方法存在差距。標準品的選擇也是中藥生物活性測定法的重要問題之一，理想的生物效應評測標準品應與供試品是同質的，在一定劑量范圍內，可視為供試品不同程度的濃縮物或稀釋物，最大限度地消除測定系統誤差，但由于中藥成分復雜，目前尚無用于生物效價研究的標準品。對此，有必要建立針對某一藥理活性的標準品以量化藥理活性[1]。

2 效應成分指數評控技術

效應成分指數（ECI）是一種綜合量化的評價指標，融合了化學評價的精準性與生物評價關聯藥效和安全性的優勢，是一種關聯中藥臨床功效與活性的評價方法，克服了目前中藥質量評價指標片面、分散、脫離藥效等弊端，適用于藥效物質及活性成分相對明確的中藥。對于有效性來說，ECI越高，表明質量和療效越好;針對安全性，毒性ECI越高，表明安全性風險越高。基于效應當量（EE），還可以對不同質量的中藥進行劑量調整，從而實現療效穩定，解決質量差異對臨床療效穩定性的影響[12]。

由于不同來源的中藥化學組成存在一定的差異，這將導致它們在質量和功效方面存在顯著差異，而現有的質量評價方法不與功效相關，不能反映不同化學成分對整體藥效的貢獻度。ECI評控方法可為臨床中藥實現辨質用藥、優質優價和科學監管提供新的科學依據和技術支持。譚鵬等[24]構建了一種基于生物效價權重系數加權的多組分化學定量分析的大黃質量評控模式——致瀉效應成分指數。采用UPLC同時測定大黃中12個化學成分的含量，利用ICR小鼠便秘模型測定12個化學成分的致瀉生物效價，以番瀉苷A的致瀉生物效價為基準，得到各個化學成分的生物效價權重系數（ECE），進而計算大黃致瀉效應成分指數。該指數有望指導臨床中醫師更合理地使用不同來源的大黃：當大黃用于治療便秘時，可選用ECI數值較高（15～20）的大黃;當大黃用于治療其他疾病時，可選擇ECI數值較低（1～10）的大黃，從而避免ECI數值較高的大黃帶來的劇烈腹瀉不良反應。因此，效應成分指數方法有望成為傳統中藥質量評控方法的有益補充。程斌等[25]運用化痰效應成分指數對浙貝母品質進行評價，實現了從量到效、量中含效，可全面評價浙貝母的內在品質，為其產地加工工藝、市場流通提供客觀、可量化的參考依據。Chen等[26]建立了中藥大果飛蛾藤的ECI，對大鼠血漿中的生物效價和成分進行了分析，結果表明所建立的ECI可以有效地對大果飛蛾藤進行質量評估，同時結合一測多評法對多組分進行定量分析，可提高已建立的ECI的實際應用價值。在中藥制劑的生物評價方面，譚鵬等[27]將多指標成分同時定量分析和生物效價分析方法結合，進行大黃配方顆粒的質量評價研究，在化學成分含量測定的同時進行致瀉生物效價和體外抗血小板聚集研究，比較不同批次大黃配方顆粒的活血生物效價，結果表明10個批次間大黃配方顆粒的化學表征、致瀉、活血生物效價均存在一定的差異性，采用多組分化學表征和生物效價檢測聯用的模式可以客觀量化、更全面的反映不同批次大黃配方顆粒的整體質量差異。張慧等[28]建立基于ECI的雙黃連制劑質量控制方法，采用抗生素微生物檢定法檢測不同來源雙黃連制劑的抗菌效價，結合HPLC定量指紋圖譜與偏最小二乘-判別分析法（PLC-DA）進行“量-效”相關性分析，篩選出野黃芩苷、綠原酸、黃芩苷、連翹脂苷A為雙黃連制劑的抗菌功效成分，藥效權重系數證實所測得的抗菌效價與功效成分指數呈正相關，可實現以ECI進行雙黃連制劑的質量評控。

ECI簡單易行，能定量、定效地表征中藥質量。然而，ECI的構建也存在一些缺陷和不足。由于多種成分的協同或拮抗作用將影響中藥質量的整體評價，如何確證藥材中與臨床功效相關聯的活性成分，如何表征這些活性成分之間的協同或拮抗作用將成為ECI法面臨的挑戰[24]。

3 生物效應表達譜

生物效應表達譜（Bio-response Profile）是指在特定的實驗條件下，供試藥物作用于生物體系所表達出的一組特征生物學信息或圖譜，通常具有時間-效應或劑量-效應依賴關系[12]，包括生物熱活性指紋圖譜、基因表達譜、蛋白質表達譜、代謝物表達譜、細胞表型特征譜、生物自顯影薄層色譜等。相對于經典生物效價檢測，生物效應表達譜能反映藥物作用于生物的更多指紋和（或）動態信息[12]，具有指紋性或專屬性，不僅可以鑒別中藥的真偽優劣，還可用于中藥質量波動監測。趙恒強等[29]利用基于DPPH-HPLC技術的抗氧化活性指紋圖譜對馬糞海膽進行分析，并對具有較好抗氧化活性的馬糞海膽水提物中的成分進行篩選，結合指紋圖譜與相似度分析對不同來源的馬糞海膽進行鑒別，為海洋中藥的質量控制和真偽鑒別研究提供了新方法。

中藥注射劑成分復雜，包含多種不同化學類別的化合物，如類黃酮、皂苷和多糖等。產品質量問題是引起中藥注射劑不良反應的重要原因之一，因此對其進行質量控制與安全性評價至關重要[30]。由于化學分析方法所提供的信息與體內活性之間缺乏相關性，無法保證中藥注射劑的臨床安全性和有效性。將生物效應表達譜引入中藥注射劑的質量控制體系有助于提高其質量標準。Feng等[31]利用化學指紋圖譜和生物測定法建立了紅花注射液的質量標準，包括基于細胞的生物學特征測定和酶促測定，根據靶細胞相關的變態反應和紅花注射液的凝血酶抑制活性，可監測RBL-2H3細胞系對不同紅花注射液的反應，并獲得了相應的基于細胞的生物學特征測定信息，同時鑒定了紅花注射液中的33種化合物，其中黃芩苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷被認為是造成臨床不良反應的物質。此外，生物熱活性圖譜可以區別高溫處理樣品及污染變質樣品，全面反映模型生物的熱生物學信息，提供專屬性較強的二維信息，因此可作為化學特征圖譜的有益補充[30]。從質量均一性出發，以中藥注射劑的主要功效為著眼點，采用微量量熱法，以生物熱活性圖譜及熱動力學參數等定性定量地表征中藥注射劑的功效差異[30]，由此建立了注射用雙黃連凍干粉、注射用益氣復脈凍干粉、清開靈注射液、茵梔黃注射液等中藥注射劑的熱活性指紋圖譜[4]。該法可以靈敏準確地區分不同批次產品、不同處理樣品及污染樣品的生物活性差異，實時監測中藥注射劑的質量信息，為其質量一致性和穩定性評價提供新的方法。

4 基于生物活性與效應基準的中藥質量評價技術存在的問題

基于生物活性與效應基準的中藥質量評價技術雖然取得了重要進展，但其對臨床合理用藥和臨床療效提升的指導和支持作用一直難以體現[4]，具體存在以下問題亟待解決。首先，復方中某些具有傳統藥理功效的成分由于含量較低，所占比例小，未達到起效濃度，可能顯示不出其生物評價效應。中藥質量生物評價方法不同于一般的藥理學實驗及化學評價，其與藥理藥效評價的區別在于前者的最終目的是對中藥及其制劑的質量進行評控，而后者僅僅在于篩選藥理成分及探討作用機制。中藥質量生物評價須具備定量藥理學與藥檢分析的雙重屬性和要求，其方法學考察既包括試驗設計、量化指標、劑間距、分組、對照、可靠性檢驗等定量藥理學的內容，還包括線性范圍、精密度、重現性等藥物分析的內容[4]。且在生物評價的過程中，不應以化學評價中的方法學指標為參照，其專屬性、準確性及檢驗誤差等不及理化鑒定，但由于其針對主要功效即可建立相關性好、操作性強的檢測方法，與中藥的安全性、有效性相關聯，加之采用生物鑒定設計和統計方法，因此具有較好的重現性和穩定性。

其次，生物評價方法的通用性較差，難以同時滿足數量眾多的中藥及其制劑的質量評控。由于中藥成分復雜，如何有效地進行生物效應評價是一個需要不斷探索和完善的問題[32]。同時，中藥質量生物評價短時間內難以在基層檢驗機構和研究機構全面普及，即存在一定的可及性和普適性難題，因此至今尚未建立中藥生物效應評價法的標準體系。

5 結語

中藥現代化、國際化發展的關鍵在于中藥的安全性、有效性、質量穩定性與質量標準的完全控制[10]。基于化學基準的中藥質量控制模式由于脫離中藥多成分協同起效的整體性特點，不能準確反映臨床療效、評價中藥及其制劑的質量。中藥生物效應法作為一種新的質量控評手段，具有藥效相關、整體可控的優勢，將成為中藥質量標準化的重要發展方向。見圖2。

生物效價測定法可以很好地反映中藥的整體活性和臨床療效，在評價中藥質量的安全性和有效性方面具有獨特的優勢;效應成分指數整合了化學評價和生物評價的技術優勢，具有多指標整合量化集成的特點;生物效應表達譜具有專屬性和特異性，可促進中藥質量一致性評價。但生物評價仍尚處于探索階段，應與理化分析技術結合使用、互為補充，以更科學、有效地進行中藥質量控制。針對不同功效的中藥，應選擇能夠反映其臨床療效的生物活性測

定方法，進行全面、深入地研究，制定關聯臨床、可量化的質量評控體系，促使中藥產業高質量發展。

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（2020-07-01收稿 責任編輯：王明）

基金項目：國家重點研發計劃項目（2018YFC1706900）;中國藥科大學雙一流建設創新團隊項目（CPU2018GY11）作者簡介：張萌（1997.02—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中藥制劑，E-mail：zhangmengcpuer@163.com通信作者：封亮（1981.03—），男，博士，副教授，博士研究生導師，研究方向：方藥物質基礎“組分結構”理論、技術與應用，E-mail：wenmoxiushi@163.com;賈曉斌（1966.09—），男，博士，教授，博士研究生導師，研究方向：方藥物質基礎“組分結構”理論、技術與應用，E-mail：jiaxiaobin2015@163.com