西地那非對高糖培養施旺細胞保護作用的機制研究

黃歡捷 王訊 程一帆 鄧斌斌 黃崇礎 張萬里

[摘要] 目的 探討西地那非對高糖培養施旺細胞保護作用的研究。 方法 培養并純化后的大鼠施旺細胞為研究對象，分為正常對照組、高糖組、滲透壓對照組 、高糖加不同濃度西地那非組 。CCK-8法檢測細胞活性，流式細胞術檢測細胞活性氧（ROS），Tunnel法檢測細胞凋亡率，Western blot 法檢測細胞Nrf-2的表達。 結果 高糖組施旺細胞內Nrf-2蛋白表達降低[高糖組（0.33±0.04），正常對照組（1.00±0.05）]，ROS水平增高[高糖組（50.61±6.75），正常對照組（23.44±4.18）]，細胞凋亡率升高[高糖組（36.62±3.15），正常對照組（4.53±0.26）]，細胞活性下降[高糖組（0.91±0.17），正常對照組（1.65±0.25）]。不同西地那非能上調高糖培養施旺細胞內Nrf-2 蛋白表達，降低細胞內ROS水平，抑制細胞凋亡，提高細胞活性。 結論 西地那非可能通過激活Nrf-2信號通路誘導抗氧化應激保護高糖環境下的施旺細胞。

[關鍵詞] 高糖;西地那非;施旺細胞;氧化應激

[中圖分類號] R587.2;R747.9 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）18-0028-04

A study of the mechanism of sildenafil's protective effect on Schwann cells cultured in high glucose

HUANG Huanjie1 ? WANG Xun1 ? CHENG Yifan1 ? DENG Binbin1 ? HUANG Chongchu2 ? ZHANG Wanli1

1.Department of Neurology， Division Ⅰ， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou ? 325015， China; 2.Wenzhou Medical University， Wenzhou ? 325015， China

[Abstract] Objective To investigate the study of sildenafil's protective effect on Schwann cells cultured in high glucose. Methods The cultured and purified Schwann cells of rats were taken as research subjects and divided into the normal control group， the high glucose group， the osmotic pressure control group and the high glucose plus different concentrations of sildenafil group. CCK-8 method was used to detect the cell activity， flow cytometric method was used to detect reactive oxygen species（ROS） of the cells， Tunnel method was used to detect the apoptosis rate of the cells， and Western blot method was used to detect the Nrf-2 expression of the cells. Results The protein expression of Nrf-2 in Schwann cells in the high glucose group decreased[（0.33±0.04） in the high glucose group， （1.00±0.05） in the normal control group]， the ROS level increased [（50.61±6.75） in the high glucose group， （23.44±4.18） in the normal control group]， the apoptosis rate of the cells increased [（36.62±3.15） in the high glucose group， （4.53±0.26） in the normal control group]， and the cell activity decreased [（0.91±0.17） in the high glucose group， （1.65±0.25） in the normal control group]. Different concentrations of sildenafil could upregulate the protein expression of Nrf-2 in the cells， reduce the ROS level in the cells， inhibit the cell apoptosis and improve the cell activity on Schwann cells cultured in high glucose. Conclusion Sildenafil may protect Schwann cells in high glucose environment by activating Nrf-2 signaling pathway to induce antioxidant stress.

[Key words] High glucose; Sildenafil; Schwann cell; Oxidative stress（OS）

糖尿病周圍神經病變（DPN）是糖尿病發生率最高的并發癥。在病史大于20年的糖尿病患者中，DPN發生率超過50%[1，2]，DPN可出現軀體感覺障礙和下肢潰瘍，嚴重者可導致患者下肢截肢，這不僅影響患者的日常生活，同時也給家庭、社會和國家帶來沉重的經濟負擔[3]。DPN的病因發病機制尚不清楚，目前治療DPN的常規藥物只能延緩 DPN 的發生和發展，不能有效地治療或逆轉已經發生的 DPN[4，5]。因此，探索DPN機制及防治方法對提高患者存活率和改善其生活質量具有重要的臨床實踐意義。近年來提出的DPN統一機制學說表明高糖可引起線粒體中活性氧自由基（ROS）生成過多，進而導致氧化應激，從而最終導致周圍神經病變[6]。本文前期研究采用西地那非（Sildenafil，Sil）干預糖尿病腎病（DN）大鼠，首次發現抗氧化應激分子 Nrf-2分子的表達水平在干預后顯著提升，此結果預示Nrf-2 通路的抗氧化應激機制參與了改善腎損傷[7]。故本研究將探討西地那非對高糖環境下大鼠施旺細胞（rat Schwann cell，RSC96）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源

新生5 d Wistar大鼠（溫州醫科大學動物房提供）;DMEM培養基（美國THERMO公司）;PBS、膠原酶（Collage-rlase NB4，德國SERVA公司）;中性蛋白酶（dispase Ⅱ，美國SIGMA公司）;高糖DMEM培養基、胰酶（美國 HyClone公司）;D-葡萄糖（北京 Solarbio公司）;雙抗（美國 Bio-sharp公司）;CCK-8 試劑盒（日本同仁公司）;西地那非50 mg/片（美國輝瑞公司），Nrf-2 和β-actin（英國 abcam公司）細胞凋亡試劑盒，離心機（美國 Beckman公司），倒置相差顯微鏡（日本 Olympus公司）。

1.2 施旺細胞的培養、純化及標記鑒定

將新生5 d Wistar鼠采用乙醚麻醉后，取下整段坐骨神經，置于平衡鹽液體中進行分離，注意無菌條件和仔細剝離神經外膜。坐骨神經剪碎后將松散組織置于含有20%胎牛血清的DMEM培養基中培養24 h，每 3天換液1次。觀察細胞生長情況備用，采用差速貼壁法進行純化培養。通過形態學觀察及應用 ABC 法免疫細胞化學染色法進行施旺細胞鑒定[8]。

1.3 實驗分組

根據前期工作，高糖濃度為50 mmol/L葡萄糖，干預時間為48 h[9，10]。將施旺細胞分組如下：①正常對照組（con）：5.6 mmol/L葡萄糖培養;②高糖組（HG）：50 mmol/L葡萄糖培養;③滲透壓對照組（mannitol）：5.6 mmol/L葡萄糖+44.4 mmol/L甘露醇培養;④高糖加不同濃度西地那非組（西地那非濃度分別為 10、30、100 μmol/L） 。

1.4 各組細胞活性檢測

施旺細胞活性檢測采用CCK-8法：細胞倍增時間取培養的細胞，用完全培養基制備3×104個/mL的細胞懸液，按每孔1500個細胞接種到96孔細胞培養板中，每組4個復孔，培養過夜，然后按照實驗分組，各組加入培養基 200 μL，培養箱中培養48 h 后，每孔加入 100 μL標準培養基和10 μL細胞懸液，培養箱內孵育2 h后，應用超微量分光光度計測定450 nm處的吸光度，重復檢測3次。

1.5細胞內ROS的檢測

細胞內ROS采用熒光探針 2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）檢測。培養結束后向培養板的細胞中加入DCFH-DA，使其終濃度為12 μmol/L。在室溫、5%CO2的條件下孵育20 min，用PBS洗滌細胞3次后，流式細胞儀檢測細胞熒光強度（激發探針熒光信號的光波為485 nm，用熒光顯微鏡記錄熒光信號），分析和計算施旺細胞內的光密度值。

1.6 細胞凋亡的檢測

經不同條件作用48 h后，0.25%胰酶消化收集各組細胞，用多聚甲醛固定經PBS洗滌二次后的各組施旺細胞，孵育打孔后滴加Tunnel反應液，混合均勻，在室溫條件下濕盒中避光孵育1 h。經PBS洗滌三次后滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察，一旦出現棕黃色顆粒即終止反應。施旺細胞核呈深棕為陽性。隨機選取5個視野下凋亡細胞數及總細胞數的比值表示每組細胞凋亡率。

1.7 Western blot法檢測Nrf-2的表達

培養結束后分組提取細胞的全部蛋白，應用考馬斯亮藍法定量并調整蛋白濃度為 5 μg/μL，加入蛋白上樣緩沖液混勻。取樣品經10%的分離膠電泳2 h后將蛋白轉移至NC膜，室溫條件下BSA封閉2 h，加入相應一抗，4℃孵育過夜后洗滌一抗，洗滌要充分，再加入相應二抗室溫孵育2 h。充分洗滌二抗后 ECL顯色、曝光和拍照，圖像軟件對蛋白條帶的光密度值進行分析，Nrf-2蛋白相對表達量以β-actin作為內參。

1.8 統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件進行結果分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，用單因素方差分析比較組間差異，兩組間比較用Student-Newman-Keuls，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞純度

施旺細胞特異性蛋白采用S-100標記，經免疫熒光染色后，可以使表達S-100蛋白的施旺細胞胞漿發出綠色熒光。所有活細胞的細胞核經DAPI內的DNA結合后發出藍色熒光。通過每次5個樣本的S-100陽性細胞計數與DAPI陽性細胞計數的比例得到施旺細胞純度，計算3次，平均細胞純度為（94.8±0.27）%。見封三圖2、表1。

2.2 西地那非對施旺細胞活性的影響

與正常對照組相比，高糖組細胞活性明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）。與高糖組相比，不同劑量西地那非干預后細胞活性明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。滲透壓對照組細胞活性與正常對照組相比差異無統計學意義（P>0.05），見表2、圖1。

2.3 西地那非對細胞內ROS水平變化

高糖組施旺細胞內ROS水平與正常對照組相比明顯增高，差異有統計學意義（P<0.01）。與高糖組相比，西地那非干預后，施旺細胞內ROS水平明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）。滲透壓對照組與正常對照組施旺細胞內ROS水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2、圖1。

2.4 西地那非對各組細胞凋亡率的影響

高糖組施旺細胞凋亡率與正常對照組相比明顯增高，差異有統計學意義（P<0.01）。西地那非干預后施旺細胞凋亡率明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）。滲透壓對照組與正常對照組相比施旺細胞凋亡率差異無統計學意義（P>0.05），見表 2、圖1。

注：Sil：西地那非;與正常對照組比較，*P<0.01;與高糖（HG）組比較，#P<0.01

2.5 各組細胞Nrf-2蛋白表達

蛋白免疫印跡結果顯示：與正常對照組相比，高糖組Nrf-2蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）。與高糖組相比，不同劑量西地那非干預后Nrf-2蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。滲透壓對照組Nrf-2蛋白表達與正常對照組相比差異無統計學意義（P>0.05）。見表3、圖2、3。

注：Sil：西地那非;與正常對照組比較，*P<0.01;與高糖（HG）組比較，#P<0.01

3 討論

盡管高糖是DPN 發病的首要因素，但具體機制仍未闡明。高糖可以通過多元醇途徑的細胞內山梨醇堆積啟動氧化應激，通過蛋白激酶C激活導致糖、脂肪代謝障礙，通過蛋白質及核酸非酶促糖基化增加引起蛋白質及核酸功能失常等途徑導致DPN[9]，然而線粒體內ROS生成過多是目前公認的導致糖尿病周圍神經病變的核心機制[10]。節段性脫髓鞘是DPN最主要的病理改變，而周圍神經的髓鞘是由施旺細胞形成的，施旺細胞在周圍神經損害修復中起著重要的作用，因此成為DPN治療中非常重要的靶細胞[11]。

ROS是在維持細胞三羧酸循環過程中產生的。正常情況下，細胞內的抗氧化應激系統可以通過MnSOD、GPX等酶清除ROS以保持細胞內的代謝平衡。但機體在缺氧、高糖等病理條件下細胞內ROS清除能力會顯著下降，同時ROS的產生會增加，導致機體內ROS 的大量堆積，從而造成組織器官的氧化應激損傷。因此ROS是反映細胞內氧化應激水平的直接指標[12]。本研究結果顯示體外高糖條件下培養48 h的施旺細胞內ROS濃度明顯增高，施旺細胞凋亡率明顯上升，表明高糖可以顯著提高施旺細胞內氧化應激水平導致細胞凋亡。而滲透壓對照組的結果提示高糖是引起施旺細胞損害的直接原因，與滲透壓無關。

西地那非是一種5型磷酸二酯酶抑制劑（PDE-5i），已被用于治療勃起功能障礙[13]。其通過抑制PDE-5使NO-cGMP-PKG通路中cGMP濃度上升，通過抑制超氧化物形成來降低氧化應激[14，15]。Wang L等[16]證實，PDE-5i可顯著增加糖尿病小鼠坐骨神經中的功能性血管和局部血流量，同時增加坐骨神經的神經纖維密度和感覺傳導速度。Nrf-2可以控制多種抗氧化基因和酶對氧化應激的表達，屬于轉錄因子CNC家族。其與胞漿蛋白伴侶分子Keap1結合時處于抑制狀態，Nrf-2發生磷酸化后解偶聯、轉移入核，識別并結合ARE結構，啟動如HO-1、GST、SOSTM等在內的一系列抗氧化蛋白表達上調，發揮抗氧化效果[17，18]，最近的研究發現Nrf-2在坐骨神經中亦有很好的表達和活化[19-21]。本研究以三種濃度西地那非處理高糖培養施旺細胞，結果顯示西地那非改善了高糖對施旺細胞的氧化應激損傷，西地那非組較高糖組，其施旺細胞活性增加，凋亡率下降，表明西地那非對高糖環境下施旺細胞具有保護作用，同時西地那非可以顯著提升施旺細胞 Nrf-2 蛋白的表達水平，提示西地那非可能通過激活Nrf-2信號通路誘導抗氧化應激改善高糖對施旺細胞的氧化應激損傷。

綜上所述，高糖可通過促進施旺細胞內氧化應激水平抑制細胞增殖，促進細胞凋亡;而西地那非可能通過激活Nrf-2信號通路誘導抗氧化應激改善高糖對施旺細胞的氧化應激損傷，保護高糖環境下施旺細胞，這可能為西地那非在DPN的臨床治療提供新的理論依據和實驗基礎。

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（收稿日期：2019-12-10）