輸卵管妊娠滋養細胞的體外培養與鑒定

簡詠男 鄭文蘭

[摘要] 目的 探討人輸卵管妊娠滋養細胞體外培養的方法與鑒定。 方法 取在貴州中醫藥大學第一附屬醫院婦科住院部住院的早期輸卵管妊娠3例患者的絨毛組織，采用膠原酶-胰酶混合消化法消化細胞，差速貼壁法純化分離細胞，最后通過免疫熒光共聚焦方法對培養出的細胞進行細胞鑒定。 結果 免疫熒光雙標記染色檢測到角蛋白與波形蛋白共表達。 結論 通過顯微鏡和免疫熒光檢測細胞外形和骨架，初步判定該細胞可能為滋養細胞。

[關鍵詞] 滋養細胞;原代培養;細胞鑒定;胎盤絨毛;胰酶消化

[中圖分類號] R711 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）07（a）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the methods and identification of tubal pregnancy trophoblasts in vitro. Methods The villi of 3 patients with early tubal pregnancy admitted to the Department of Gynecology， the First Affiliated Hospital of Guizhou University of Chinese Medicine were taken. Collagenase-trypsin mixed digestion method was used to digest cells， and differential adherence method was used to purify and isolate cells. Finally， the cells were identified by immunofluorescence confocal method. Results Co-expression of keratin and vimentin was detected by immunofluorescence double-labeling staining. Conclusion Microscope and immunofluorescence can detect cell shape and skeleton. It is preliminarily determines that the cell may be a trophoblast cell.

[Key words] Trophoblast cell; Primary culture; Cell identification; Placental villi; Trypsin digestion

近年來，異位妊娠發病率呈現年輕化趨勢，且逐年上升，為保留治療后輸卵管的完整性，提高今后的再次受孕率，中藥治療因其副作用小而備受人們關注，且在臨床治療中也取得了滿意的效果，但其機制研究尚處于初級階段。由于在人體無法進行相關的在體研究，因此輸卵管妊娠絨毛滋養細胞的體外培養便成為進行相關實驗研究的前提。本研究將早期的人輸卵管妊娠患者的絨毛組織進行體外培養，為后期輸卵管妊娠疾病的相關研究提供較好的模型，為推動中藥治療異位妊娠滋養細胞疾病提供良好的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 絨毛組織

選取在貴州中醫藥大學第一附屬醫院婦科住院部住院的早期輸卵管妊娠患者3例，妊娠周數為孕5～8周，平均（6.33±0.58）周;孕婦年齡20～30歲，平均（26.67±2.08）歲;無其他疾病;未經藥物治療;直接手術的輸卵管妊娠患者的新鮮絨毛組織。患者本人對本研究知情同意。

1.2 主要試劑及儀器

膠原酶Ⅰ（貨號：C8140）、DAPI染色液（貨號：C0065）、5%BSA封閉液（貨號：SW3015）、曲拉通X-100（貨號：T8200）：北京索萊寶生物科技有限公司;PBS緩沖液（貨號：SH30256.01）、胰酶消化液（貨號：SH30042）、胎牛血清（貨號：SH30406.02E）：美國HyClone;異硫氰酸熒光素（FITC）標記的鼠抗人角蛋白18（貨號：bs-2043R）、熒光素（Cy3）標記的鼠抗人波形蛋白（貨號：bs-0756R）：北京博奧森生物技術有限公司;4%多聚甲醛（貨號：DF0135）：安徽雷根生物技術有限公司;倒置顯微鏡（型號：BX41TF）：日本Olympus;激光共聚焦顯微鏡（型號：DM4000B）：德國Leica;高速冷凍離心機（型號：Microfuge 20R）：美國Beckman Coulter。

1.3 滋養細胞的取材及培養

根據文獻[1]將輸卵管妊娠的絨毛組織在無菌條件下置于含雙抗（青霉素、鏈霉素）的PBS中，取樣1 h內冰上運送至實驗室。于超凈工作臺內，PBS反復洗滌絨毛組織以去除血污，眼科剪將組織剪碎至1 mm3左右，收集至離心管中，1000 r/min，離心10 min，棄上清，加入0.125%胰酶+0.1%Ⅰ型膠原酶1∶1復合消化液，37℃水浴中將其消化20 min。消化完畢后加入10%胎牛血清（FBS）終止消化，離心，棄上清。加入含20%FBS的培養液懸浮細胞，反復吹打混勻后接種于培養瓶中，放置在37℃二氧化碳培養箱中繼續培養。24 h首次換液，以后每隔48 h常規換液 1次。

1.4 差異貼壁法分離滋養細胞

當細胞貼壁生長至80%～90%時，吸去培養液，PBS洗后加入0.25%胰酶消化細胞并置于二氧化碳培養箱中孵育5 min，加入10%FBS終止消化，1000 r/min，離心5 min，棄上清。鋪入新的培養瓶中，加20%FBS培養液3 mL，輕輕吹打后，于二氧化碳培養箱中靜置20 min，采用差速貼壁法將其進行分離純化，在顯微鏡下觀察到最先貼壁的為成纖維細胞，滋養細胞大多為懸浮細胞，將其懸浮的培養液收集于另一培養瓶中，重復5次后鋪瓶，放置于37℃二氧化碳培養箱內培養。

1.5 倒置顯微鏡觀察

觀察細胞貼壁時間、細胞生長形態、原代生長周期。待細胞長到80%～90%時，用胰酶消化傳代。

1.6 人輸卵管妊娠絨毛滋養細胞的鑒定

將第4次傳代的滋養細胞，計數板計數，以2×106個/mL的濃度接種于激光共聚焦皿中，24 h后，用PBS清洗，加入4%多聚甲醛，室溫下固定15 min。PBS洗3次后，用0.1%曲拉通X-100增加細胞膜通透性，PBS洗滌細胞3次，加入5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h;去血清后滴加1∶1混合的異硫氰酸熒光素（FITC）標記抗人細胞角蛋白18（CK18）、熒光素（CY3）標記抗人波形蛋白各25 μL，4℃孵育過夜。次日取出后復溫，用PBS重復洗滌細胞3次后滴加DAPI染核，避光室溫下染色后加入PBS沖洗3次，激光共聚焦顯微鏡檢測該體外培養的細胞角蛋白和波形蛋白的表達情況。

2 結果

2.1 滋養細胞一般形態

原代培養滋養細胞接種后于倒置顯微鏡下可見大量圓形細胞懸浮存在，1 h后細胞開始慢慢貼壁，有個別細胞開始伸展，24 h后可明顯見大部分細胞已經貼壁，48 h后大部分細胞伸展，到第9、10天細胞的數量明顯變多，可見細胞呈扁平不規則的三角形或多邊形，片狀平鋪生長，核較圓，胞質豐富，部分細胞連接成片，少量細胞呈長梭形。見圖1。14 d長到80%～90%可傳代，傳代后3～4 d為1代。

2.2 人輸卵管妊娠絨毛滋養細胞的鑒定

免疫熒光雙標記檢測結果顯示：在細胞質中出現角蛋白和波形蛋白共表達的黃色部位。見圖2（封四）。

3 討論

目前，細胞體外培養的技術已成為研究滋養細胞相關疾病的重要手段，其關鍵步驟在于人滋養細胞體外分離的培養成功。妊娠期滋養細胞體外培養分為原代培養、分離純化、傳代培養和細胞鑒定4個階段[2]。

本研究選取20～30歲女性，5～8周內早期輸卵管妊娠患者。為提取活力較強的滋養細胞，應盡可能地選擇青年女性[3]，以便提高滋養細胞體外培養的成功率。

取回胎盤組織后，用PBS緩沖液認真清洗，清除明顯的血塊及筋膜組織后，剪取絨毛，使其絨毛組織完全剪碎至糊狀后進行消化分離。目前原代培養的分離方法主要分為組織塊法和酶消化法2種[4]。組織貼塊法操作簡單，但原代細胞生長周期較長，需20 d左右，細胞純度低且容易污染[5]，因此，該方法不建議用于滋養細胞的體外培養。胰蛋白酶消化法包括單一胰蛋白酶消化法和復合酶消化法，一般的酶消化法雖然能夠快速地得到大量的細胞，但容易混入成纖維細胞且在反復消化細胞的同時對細胞的損傷比較大[6]，而膠原酶比較溫和，還可以幫助分解間質細胞，但對上皮細胞影響不大[7]。故本研究選用膠原酶-胰酶混合消化法來消化細胞。

滋養層細胞的分離無論是采用組織塊法或是酶消化法，細胞懸液里面都會含有血管內皮細胞、Hofbauer細胞、成纖維細胞及血細胞等[8]，故排除其他雜質細胞的污染是純化滋養細胞的關鍵。因血管內皮細胞、Hofbauer細胞及血細胞等不屬于貼壁細胞，多次換液中就可以去除。而成纖維細胞的貼壁能力較滋養細胞強，其具有先貼壁的特性，為提高其純化度及分離細胞的簡便，本研究采用差速貼壁法。也有很多研究者采用的是Percoll密度梯度分離法，其中，最為成熟的是Kliman等[9]發現的Percoll密度梯度分離法。Percoll本質上是一種經聚乙烯吡喀烷酮化學加工的硅膠顆粒，雖然其具有密度高、不穿透細胞、無毒害等特點[10]，但該方法操作繁瑣、試劑消耗成本大，在普通實驗室難以推廣。

最后，所獲得的細胞是不是滋養細胞還需要做細胞鑒定。本研究發現，該細胞在顯微鏡下呈不規則三角形或多邊形，平鋪整個視野，其生長形態與滋養細胞相吻合。但顯微鏡下細胞的一般形態描述不能用于細胞定性，細胞鑒定還需檢測細胞骨架。目前滋養細胞的鑒定沒有統一的標準，細胞角蛋白與波形蛋白的分析比較，是界內較為認可的鑒別方法[11]。波形蛋白是間質細胞的標志蛋白[12]，而細胞角蛋白，因其獨特的細胞結構，是構成上皮細胞骨架的特有蛋白[13]。徐娟等[14]研究發現，滋養細胞只特異性表達細胞角蛋白。故可借此來辨別滋養細胞和間質細胞等其他細胞。

本研究采用了直接免疫熒光雙標記染色法檢測細胞中角蛋白和波形蛋白表達。結果顯示，在細胞質中，存在CK18和波形蛋白共表達部位。近年來文獻報道[15]顯示，上皮細胞也可以表達波形蛋白，因此，波形蛋白表達陽性并不能否認該體外培養的細胞不是滋養細胞，有可能該細胞在體外培養的過程中，細胞性狀發生了改變，向間質細胞方向轉化了。近些年也有學者發現在一些滋養細胞中，也存在波形蛋白表達陽性[16-17]。但因文獻時間較久，故此體外培養的滋養細胞未用于后期的實驗研究。據文獻報道[18]體外培養所得的原代細胞產量高，生長周期短，7 d左右可生長成片，本研究結果顯示原代細胞經過14 d培養后才可進行初次傳代，與文獻報道略有出入。筆者分析其細胞活力、胰酶濃度、消化時間、實驗室環境及操作人員均可能成為影響細胞生長的因素，均可能影響其研究結果，每一步驟掌控不好都有可能造成活細胞的變性。在分離純化的過程中，有些組織和細胞耐受性較差，也會損害細胞的結構，從而影響細胞的生長時間或貼壁細胞變性[19-22]。因此在研究中需注意的一些問題：①取材患者的年齡越小，組織越新鮮，更容易增加培養成功率，獲得數量更多更純的滋養細胞[23]。②獲取組織時，絨毛分支稠且送往實驗室時間短，則培養時更易得到數量更多活力更好的細胞。③使用胰蛋白酶消化傳代時，應注意胰酶的用量，而且消化時間不能太長，以免喪失部分細胞;其次，細胞傳代應保持同等時間間隔。④胰蛋白酶應時用時配，新鮮胰蛋白酶消化細胞的能力強于配制時間長的胰蛋白酶。⑤滋養細胞貼壁時間較長，首次換液時間一般為16～24 h，以后常規換液時間最好不超過2 d，以免培養基營養成分耗盡造成細胞死亡。⑥絨毛組織越碎，細胞消化就會更加充分。

綜上，結合顯微鏡和免疫熒光的結果，初步判定此體外培養的細胞可能為滋養細胞。如何獲得數量豐富且純度較高的滋養細胞仍是目前研究的熱點，如能進一步研究出該細胞更多的生長特性和其他標志性的指標，將為各種滋養細胞相關疾病提供實驗基礎，為廣大患者帶來福音。

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（收稿日期：2020-01-08）