藥用植物內生真菌的研究進展

謝海偉 馮嘉琪 付曉晴 江坤生 陳佳茹

摘要：植物內生真菌廣泛存在于藥用植物體內，具有豐富的生物多樣性，對寄主植物有著積極的作用，內生真菌的次生代謝產物有著抗腫瘤、抗氧化、抗菌等活性，在醫藥、農業、食品等行業有著巨大的應用前景。本文綜述了近年來藥用植物內生真菌的研究進展，在藥用植物內生真菌的分離篩選技術、檢測方法、鑒定技術等方面進行闡述，在藥用植物內生真菌的種屬多樣性、代謝產物生物多樣性方面進行分析;對藥用植物內生真菌在醫藥行業和農業中的應用等進行總結，并對現今藥用植物內生真菌的相關研究存在的問題進行分析，并對內生真菌的未來應用提出展望。

關鍵詞：藥用植物;內生真菌;分離篩選;多樣性;應用

中圖分類號： Q949.95;S182? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）14-0001-05

收稿日期：2019-07-24

藥用植物內生真菌是天然藥物的重要組成部分，其活性代謝產物豐富多樣，包括各種結構類型獨特、具有潛在應用前景的活性物質，已成為發現新高效、新穎、低毒的天然活性物質的重要資源。目前發現內生真菌的種類多達100萬種[1]。目前的主要研究集中于宿主植物與內生真菌共生機制和內生真菌天然代謝產物的功能關系等方面，植物內生真菌的次級代謝產物具有抗氧化性、抑制病原微生物、抗腫瘤、抗蟲等功能，能被廣泛應用于醫藥、農業、環境保護等方面。近年來，藥用植物的內生菌已成為研究熱點之一，如內生真菌天然代謝產物的生物活性、藥用內生真菌促進新型藥物的開發、藥用植物內生真菌的次級代謝產物對宿主植物的生長和抗病蟲害機制等方面的研究。而藥用植物內生真菌在藥用、醫用等方面的作用更為顯著，部分藥用內生真菌可以分泌與寄主相同或相似的藥用成分。在藥用植物自然更新慢、有效藥用成分提取率低、人為采取過度導致生物多樣性降低的背景下，開發藥用內生真菌是一個有效保護珍稀藥用植物、大規模開發生產藥用活性成分的途徑。本文以藥用植物內生真菌為對象，就其分離篩選、多樣性、在不同行業中應用及存在的問題進行分析和闡述。

1 藥用植物內生真菌篩選

藥用植物內生真菌分離流程包括藥用植物樣本采集，樣本消毒處理，內生真菌的分離及培養，內生真菌的鑒定，內生真菌及代謝產物性能分析。

1.1 藥用植物內生真菌篩選預處理

藥用植物內生真菌分離篩選預處理是控制藥用植物表面的殺菌強度，防止誤殺部分內生真菌或者混入表生真菌，影響植物內生菌分離效果的操作。根據植物類別及植物組織類型，可以采用75%乙醇+次氯酸鈉溶液的表面消毒和75%乙醇+氯化汞2種表面消毒方式。75%乙醇與氯化汞的結合消毒較徹底，缺點是氯化汞的毒性大并且對環境有一定的危害作用。Adeyemi等在研究內生真菌篩選時發現，在徹底表面滅菌的前提下，殺菌劑高濃度短時間處理，藥用植物內生真菌的分離效果更顯著[2]。藥用植物內生真菌的表面滅菌效果檢測方法有3種，分別是漂洗液檢驗法、組織印跡法和超凈工作臺無菌狀態檢測對照法。

1.2 藥用植物內生真菌分離篩選

藥用植物內生真菌的分離篩選一般是采用組織分離法和研磨涂布法，其中組織分離法的操作工序較為簡便，因此目前多采用組織分離法。分離藥用植物內生真菌的常用培養基有馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）[3]、玉米粉瓊脂（CMA）、麥稈煎液瓊脂（WSA）、麥芽浸出液瓊脂、水瓊脂（WA）、沙氏葡萄糖瓊脂、沙氏麥芽糖瓊脂、以及查氏瓊脂（CAZ）培養基，其中以PDA培養基最為常用。此外在培養基中加入100 μg/mL氨芐青霉素或（和）100 μg/mL硫酸鏈霉素等抗生素可有效抑制細菌的生長。分離出的內生真菌一般采用PDA培養基純化培養。章苗等采用拮抗試驗和體外抗菌測試方法，利用馬鈴薯葡萄糖雙抗培養基在22 ℃低溫條件培養下從無患子內成功篩選出6株內生真菌[3]。藥用植物內生真菌的篩選包括內生真菌產生長激素活性物質篩選、內生菌拮抗病原真菌篩選、抑菌活性篩選、抗腫瘤細胞活性篩選以及促生特性的篩選等。張亮等對分離得到的杜仲內生真菌進行活性篩選，發現有18個菌株對病原真菌具有顯著的拮抗作用[4]。魏練平等從山蒼子葉中分離篩選出2株內生真菌，它們對人肝癌HepG2細胞有明顯抑制作用[5]。

1.3 藥用植物內生真菌的鑒定

藥用植物內生真菌的鑒定方法主要有形態學鑒定、理化鑒定和分子生物學鑒定，具體包括[6]：（1）形態學鑒定。主要根據菌株個體和菌落群體的形態特征進行鑒定，觀察內生真菌菌落的形狀、大小、顏色等特征，結合在光學顯微鏡或電子掃描電鏡下觀察到的菌株個體的孢子、產孢結構等特征，依據真菌鑒定手冊對其進行鑒定。（2）酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）法。ELISA技術因準確度高、特異性強、適用范圍廣、檢測樣本多、速度快，并且條件要求比較低，方便操作，被廣泛運用在藥用內生真菌的檢測分析上。（3）利用次生代謝物間接檢測。產生次生代謝物是藥用內生真菌最重要的特征，也是采用這種方法檢測內生真菌的重要依據。通過氣相色譜（GC）、質譜方法（MS）以及高效液相色譜法（HPLC）檢測次生代謝物的含量可間接地檢測內生真菌。這些藥用內生真菌次生代謝產物的檢測方法可間接證明內生真菌是否存在。（4）分子檢測法。可以通過保守基因測序進行內生真菌種類鑒定;通過各種分子標記技術進行內生真菌基因型分析;通過高通量測序技術、基因組測序技術，對內生真菌的系統進化進行深入分析，可為尋找內生真菌與藥用植物相互作用的基因奠定重要的基礎。

2 藥用植物內生真菌多樣性的研究

2.1 內生真菌種屬類型

近年來，科學家從各種藥用植物當中分離出來的內生真菌共171屬。植物內生真菌豐富多樣，大多數植物體內含有內生真菌，且種類繁多。在多數植物中，內生真菌分屬于以下幾個屬，即擬隱孢霉屬、擬莖點霉屬、半殼霉屬、葉點霉屬等。目前研究的植物內生真菌絕大多數屬于子囊菌類的核菌綱、腔菌綱和盤菌綱，無孢菌群的多類真菌和半知菌中的鏈格孢屬、青霉屬、鐮刀菌屬等。

孫璐等從毛序棘豆的根、莖和葉中分離得到的內生真菌共有29株，經鑒定分屬于4綱、5目、6科、10屬，優勢菌屬是鐮刀菌屬和鏈格孢屬，分布最廣泛的為木霉菌屬[7]。艾洪蓮等從馬鈴薯植株中分離得到44株具有生物活性的內生真菌，分屬于21個屬，分別是毛殼菌屬、籃狀菌屬、曲霉屬、鏈格孢屬、螺旋聚孢霉屬、裂褶菌屬、枝孢屬、單端孢屬、莖點霉屬、離蠕孢屬、殼二孢屬、炭角菌屬、白僵菌屬、鐮孢菌屬、附球菌屬等，其中毛殼菌屬、籃狀菌屬和附球菌屬為優勢菌屬[8]。李盼盼等從傳統藥用植物煙草中共分離得到539株內生真菌，經過rDNA-ITS系統發育分析鑒定為31屬、73種，其中曲霉屬和鐮孢屬為煙草的優勢菌群[9]。唐青等從艾納香的根、莖和葉中分離得到內生真菌共152株，經鑒定分屬于11個屬，分別是鐮刀菌屬、木霉菌屬、脈孢菌屬、間座殼屬、多節孢屬、曲霉屬、青霉屬、彎孢菌屬、莖點霉屬、煙管霉屬和蠟質菌屬，其中鐮刀菌屬、曲霉屬、木霉菌屬和彎孢菌屬為艾納香內生真菌的優勢菌屬[10]。Manganyi采用形態學和分子生物學技術研究天竺葵內生真菌的生物多樣性，共分離鑒定出真菌133株，其中青霉屬真菌占優勢[11]。

2.2 內生真菌組織分布多樣性

藥用植物內生真菌的多樣性決定了其次生代謝產物的多樣性。內生真菌在藥用植物中存在組織分布差異性。裴梟鑫等從黑果枸杞植株的果、根、莖、葉中分離得到內生真菌43株[12]。曹丹丹等從莖直黃芪中分離得到內生真菌336株，研究表明，莖直黃芪不同組織部位內生真菌多樣性指數不同，其中花中的多樣性指數最高，葉次之，莖最低[13]。劉軍等從檀香中分離到325株檀香內生菌，其中根部內生真菌的物種多樣性明顯較莖和葉豐富[14]。岳海梅等從西藏砂生槐中分離出77株內生真菌，其中莢果中內生真菌的分離率最高，且多樣性指數也最高，而其他部位則差異不明顯[15]。

2.3 內生真菌代謝產物多樣性

目前，從植物內生真菌次級代謝產物中分離得到的化合物主要有聚酮類、生物堿類、萜類和甾類等，這些化合物表現出良好的抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒、殺蟲等生物活性。內生真菌次生代謝產物具有不同的生物活性、多元的結構特性及多樣的合成途徑等特征。按照化學結構劃分，藥用植物內生真菌的主要代謝產物包括有機酸、揮發性物質、脂類和酶類、類固醇、多糖類和蛋白質類等初級代謝產物;還包括生物堿類、萜類、甾體類、黃酮類等次級代謝產物。Elaine等綜述了近年來藥用植物內生真菌微生物分類、化合物分類和細胞毒性的研究進展，發現次生代謝產物主要包括生物堿、萜類、甾類、聚酮類、醌類、異香豆素、酯類等化合物[16]。Peng等綜述分析了從海藻內生真菌中分離得到的182個天然產物，發現這些代謝產物具有獨特化學多樣性以及相關的生物活性[17]。Schulz等研究了植物內生菌及其生物活性代謝產物與宿主的關系，從藥用的草本植物中分離得到6 500個內生真菌，對其進行生物活性篩選，根據不同生物合成途徑其次級代謝產物可分為異戊二烯、聚酮、氨基酸衍生物[18]。

3 藥用植物內生真菌的應用

3.1 抗腫瘤方面應用

近來研究表明，從某些有抗腫瘤功能的藥用植物內生真菌中提取出的活性物質與宿主植物的次級代謝產物具有高度相似性[19]，這打破了只能從天然藥用植物中提取或采用化學合成等途徑生產藥物的傳統，開辟了一條新的抗腫瘤藥物生產路線。程玉鵬等研究表明，產柴胡皂苷內生真菌抗腫瘤機制涉及誘導腫瘤細胞凋亡、逆轉腫瘤耐藥性和增強免疫調節功能等方面[20]。Li等從紅豆杉中分離得到內生真菌紫杉霉（Taxomyces anreanae），紫杉霉產生的紫杉醇或其他紫杉烷類化合物對乳腺癌等多種惡性腫瘤具有突出功效[21]。Tao等從篩選自紅樹林的內生真菌鐮刀菌中分離到環肽白僵菌素（beauvericin），它對腫瘤細胞KB的生長有明顯的抑制作用，主要通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，對人體的多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用[22]。魏練平等從山蒼子葉中分離篩選出的內生真菌，對人肝癌HepG2細胞抑制率達63.76%，具有明顯的抗腫瘤作用[5]。Made等研究番荔枝葉內生真菌乙酸乙酯提取物的抗癌活性，當提取物濃度為100 μg/mL 時，表現出對癌細胞生長的高抑制活性[23]。

3.2 抗氧化活性應用

藥用植物及其內生真菌是發現天然產物的重要資源，多種內生真菌的代謝產物可成為新型天然抗氧化劑的潛在來源。目前已從多種藥用植物內生菌及其次生代謝產物中得到諸多具有抗氧化活性的物質，包括生物堿類、酚酸類、黃酮類、菇類、香豆素類化合物等。Huang等對29種中草藥的292株內生真菌進行了總抗氧化能力與總酚含量關系的研究，結果表明，內生真菌培養物的抗氧化能力與其總酚含量顯著相關，酚類物質是內生真菌的主要抗氧化成分[24]。鄭朝輝等發現，黃芩內生真菌的發酵產物具有抗氧化活性，從中分離得到的2種酚類化合物具有較強抗氧化能力[25]。宋新月等從竹葉蘭中分離內生真菌，篩選得到2株具有較強抗氧化活性的菌株Colletotrichum karstii和Phanerochaete sp.[26]。

3.3 抗菌活性應用

大多數內生真菌的次級代謝產物中含有能夠抑制細菌、真菌等的生物活性物質，其中發現最多的是內生真菌產生的新型抗菌肽類活性物質。Li等從雷公藤中分離得到1株能產生一種新型環肽類抗生素的內生真菌，所產生的這種環肽類抗生素含有很多稀有氨基酸，對人體中的病原真菌具有抑制作用[27]。魏永威從藿香植物的莖組織中分離出具有抑菌活性的內生真菌[28]。劉雷等研究川麥冬內生真菌的抑菌活性，結果表明，抑制白色念珠菌的菌株較多[29]。Atiphas-aworn等從羅勒葉中分離到14種內生真菌，所有內生真菌粗提物對9種人體細菌病原體金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌均有抑菌活性[30]。劉曉瑜等從22種藥用植物組織中分離出197株內生菌，經篩選獲得18株對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）有拮抗作用的菌株[31]。

4 藥用植物內生真菌應用研究中存在的問題及解決方案

4.1 內生真菌研究存在的技術問題

（1）藥用植物內生真菌的分離篩選方法存在著明顯的技術問題。目前，普遍采用組織塊分離法分離藥用植物內生真菌，在分離過程中，不徹底的表面消毒會造成內生真菌中混有雜菌，影響研究結果的準確性;這種分離方法只能分離得到部分內生真菌，難以分離得到生長緩慢且容易被優勢菌種覆蓋的內生真菌。（2）藥用植物內生真菌的培養存在技術問題。有些內生真菌在人工合成的培養基上無法正常生長、無法獲得純培養物，不利于保存與研究[32]，在表面消毒時部分敏感株容易被殺死等，導致仍然在存在大量的未被發現的新物種，仍然還有數量巨大的內生真菌資源有待研究。（3）目前，對內生真菌菌株的培養條件以及菌株自身遺傳背景進行的深入研究較少，應該加強對產活性物質菌株穩定性、菌株培養條件以及菌株誘變改造等方面的深入研究。（4）分離出來的內生真菌，當脫離宿主植物后，在體外進行傳代培養過程中會出現某些重要的生物學特性退化和消失，甚至死亡現象。解決辦法是減少傳代次數，盡量模擬內生真菌在宿主植物內的生長環境和營養條件。（5）內生真菌鑒定方法存在技術問題。目前，主要依靠真菌形態學對內生真菌進行歸類和鑒定，同時采用分子生物學方法輔助鑒定。真菌的形態學主要是以孢子形態進行鑒定的，但有的真菌在人工培養條件下不形成孢子，所以誘導內生真菌產生孢子是有必要的。盡管可利用多種方法進行誘導，但仍有很多內生真菌無法產生孢子，因此有部分分離得到的內生真菌無法進行分類鑒定。

4.2 內生真菌在應用中出現的問題

當前，已有的研究結果顯示，內生真菌的次生代謝產物具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化等活性，具有巨大的藥用價值[33]，可應用于醫藥行業，但內生真菌尤其代謝產物在產業化應用方面仍存在很多問題需要解決。（1）目前，許多研究只是通用分離篩選得到具有活性的內生真菌，并未對其發酵產物進行分離純化，且未對其化學結構進行進一步的探討。（2）內生菌與宿主植物在共同進化中產生的次級代謝產物具有高度相似性，但是內生菌生產的次級代謝產物極不穩定，活性成分的含量較低，且在頻繁傳代過程中易發生突變，導致代謝產物出現變化或可能會消失，難以進行大規模工業化生產。發酵時間不同，產生的次級代謝產物不盡一致。（3）植物內生真菌發酵可以產生與宿主植物相似的次生代謝活性產物，但仍然有許多次級代謝產物尚待明確，目前尚未深入研究內生菌次生代謝產物中起到抑制作用的大量活性物質。有些次級代謝產物發酵水平很低，1 L內生菌發酵液中僅能獲得微量的活性成分，其發酵優選工藝還有待進一步研究[32]。（4）內生真菌與宿主植物共生生態機制以及共同具有相似次級代謝產物的分子機制有待進一步研究。（5）大多數藥用植物特別是一些珍貴的藥用植物尚未開展內生真菌方面的研究，且對某些活性菌株的研究僅停留在實驗室層面，尚未進行商業化生產。（6）內生真菌本身可促進藥用植物的生長發育、抗病蟲害的能力以及活性成分的合成與分泌，在栽培藥用植物防治病蟲害等方面有著顯著的促進效果[33]。目前，對于內生真菌與寄主植物的相互作用機制尚不明確，藥用植物內生真菌產生與寄主相同或相似成分的機制還不清楚[34]，這限制了藥用內生真菌在實際中的應用。

4.3 可行的解決方案

隨著現代技術的進一步發展，內生真菌的研究和應用等方面存在的問題已有初步的解決方案。在傳統方法的基礎上，結合現代技術手段如高通量測序技術、現代色譜技術、生物化學技術等進行研究，有利于突破當前的研究現狀。在傳統研究方法的基礎上，利用現代技術手段，將成為解決內生真菌在科研和應用上存在問題的有利手段。（1）設計新型培養基，適于篩選出來的內生真菌繁殖生長、積累代謝產物，并對體外培養條件、發酵條件進行工藝優化。（2）內生真菌的培養方式由體外純培養轉為多元混合培養，對篩選分離出來的內生真菌進行復配，進行混合發酵。（3）采用高通量測序技術鑒定真菌，獲得未培養菌株。在內生真菌鑒定的方面，隨著現代分子生物學技術的逐漸應用，采用轉錄間隔區（ITS）序列、大亞基（LSU）基因等分析對形態相似的內生真菌進行鑒定[35]，同時，DNA測序結合變形凝膠電泳技術也開始應用于內生真菌的鑒定中。丁小麗等采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析對丹參葉片內生真菌群落結構進行研究[36]。（4）通過代謝組學、蛋白質組學，獲得有價值的次級代謝產物。從種類繁多的內生真菌次生代謝產物中篩選出生物活性物質也是一個加快次生代謝產物研究的突破點。基因篩選[37]是指將特定基因作為篩選標記，在基因水平上評估微生物產生某種代謝物的可能性及其產生生物活性物質的潛力。任丹等通過對川楝內生真菌進行基因篩選發現，次生代謝產物具有活性的可疑菌屬為曲霉屬和青霉屬[38]。（5）運用誘變技術或基因工程技術對分類篩選的內生真菌進行體外菌種改良，獲得遺傳穩定、代謝活性物質含量高的改良菌株。如在內生真菌次生代謝產物開發利用方面，為提高活性物質的含量，達到工業化生產水平，應將傳統的育種技術與現代育種相結合，利用基因工程等現代生物技術改良具有活性的菌株，優化生產工業。

5 結論與展望

藥用植物內生真菌具有豐富的生物多樣性，對植物的生長發育有著積極的作用，能夠產生與寄主植物相同或相似的具有生物活性的產物，在抗腫瘤、抗菌、抗氧化等方面有著明顯的效果，是醫藥行業開發新藥的新型途徑。藥用植物內生真菌的研究雖然處于起步階段，但其實用價值和社會價值己經受到越來越多的重視，從藥用植物內生真菌次生代謝產物中篩選有效的活性物質或新型化合物以研究新的藥物，將在很大程度上豐富人類醫藥寶庫，解決自然資源不足等問題，實現可持續發展。隨著技術的進步和植物次生代謝研究的深入，對藥用植物內生真菌的開發和研究必將成為重點，藥用植物內生真菌具有極大的開發利用潛力和價值。

目前，對于內生真菌的研究與應用也存在著一些問題，如大多數藥用植物尚未開展內生真菌方面的研究，這將是未來開發內生真菌資源的重要寶庫;對部分活性菌株僅停留在實驗室研究層面，尚未進行商業化生產[30];藥用植物內生真菌產生與宿主植物相似或相同的次生代謝產物的遺傳機制尚不清楚;藥用植物內生真菌與其他內生真菌、內生細菌、內生放線菌互作的多樣性及分子機制鮮有報道等。關于這些方面的深入研究將是未來藥用內生真菌研究、開發的方向。另外，如何高效準確地分離與篩選出內生真菌還有待進一步研究，且內生真菌與寄主之間的作用機制尚不清晰，具有生物活性的次生代謝產物結構不明晰。利用先進的現代生物技術手段，系統并全面地研究與開發藥用植物內生真菌有待進一步開展。

解決上述問題，不僅有利于對珍稀、瀕危藥用植物資源的保護，對減少野生藥用植物多樣性的破壞具有重要意義，而且可為利用藥用植物內生真菌生產次生代謝產物提供參考依據。充分研究藥用植物內生真菌及其次生代謝產物，可為后續發現新型菌株或新型化合物、篩選生物活性物質提供一種新途徑，在醫藥、農業等方面將會發揮巨大的作用。

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基金項目：廣東省級大學生創新創業訓練計劃（編號：201810577053、201810577007）;廣東省高校特色創新項目（編號：2017KTSCX172）;惠州學院教授/博士科研啟動經費（編號：2018JB002）。

作者簡介：謝海偉（1978—），男，吉林樺甸人，博士，教授，主要從事微生物、抗菌肽研究。E-mail：xiehaiwei324@163.com。