轉(zhuǎn)錄組解析外源ABA對玉米脫水速率的影響

李 川，黃 璐，張美微，張盼盼，劉京寶，牛 軍，喬江方

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002)

玉米是我國重要的糧食、飼料、經(jīng)濟三元作物。2018年我國玉米播種面積4 200萬hm2，總產(chǎn)量2.573億t。隨著農(nóng)村勞動力轉(zhuǎn)移及我國農(nóng)業(yè)機械化水平的提高[1-2]，生產(chǎn)上對適宜機械化收獲的玉米品種需求愈來愈高，尤其是具備籽粒脫水速率快、早熟高產(chǎn)、抗倒性好等特性的機械粒收品種[3-5]。目前，玉米脫水速率相關文獻多從植株性狀、生理特征方面進行研究。有文獻表明，玉米苞葉層數(shù)、厚度及松緊程度影響籽粒脫水速率[6-8]。玉米生理成熟時籽粒含水量與散粉時間、軸粗、百粒質(zhì)量、穗位高、根倒伏呈顯著正相關[9]，而果柄短、籽粒小有助于籽粒脫水。總之，田間自然脫水速率與植株性狀相關，低株高、高穗位、開花期較多綠葉數(shù)、高莖稈含水率、低葉片含水率、穗粗直徑小、穗行數(shù)少、籽粒寬度大、苞葉薄、百粒質(zhì)量小有利于籽粒脫水[10-12]。玉米籽粒含水量與籽粒破碎率、雜質(zhì)率、落籽率呈顯著正相關[13]。不同玉米品種脫水速率不同。白色胚乳晚熟玉米脫水速率較慢，不同熟期玉米雜交種籽粒脫水速率存在顯著差異[14]。

植物激素在作物生長發(fā)育過程起著重要的調(diào)控作用，脫落酸(ABA)尤為重要[15-16]。灌漿早期噴施外源ABA降低灌漿速率，并與ABA濃度呈正相關[17]；灌漿中期高濃度噴施外源ABA降低灌漿速率[18-19]。灌漿速率是影響玉米粒質(zhì)量的主要限制因素，進而影響百粒質(zhì)量和產(chǎn)量[20-21]。高濃度ABA破壞胚乳細胞結構，抑制胚乳細胞分裂從而減少胚乳細胞及淀粉粒數(shù)目[22-24]。玉米胚中ABA含量變化與脫水耐性相關[25]。外源ABA加快種子胚脫水速率[26]。但外源ABA影響玉米脫水速率的分子機制尚未明確。鑒于此，在灌漿早期分別對脫水速率較快的迪卡517和脫水速率較慢的鄭單1002穗部噴施外源ABA，然后利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術挖掘相關差異表達基因并注釋其功能，分析其代謝途徑和轉(zhuǎn)錄因子，以期找到ABA影響玉米脫水速率的重要響應基因及調(diào)控途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試玉米材料為迪卡517(DK517)、鄭單1002(ZD1002)。其中，DK517由中種國際種子有限公司選育，并于2017年通過國家農(nóng)作物品種審定委員會審定，審定編號：國審玉20170005，該品種生理成熟后籽粒脫水速度快葉片干枯，有利于籽粒直接收獲；ZD1002由河南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所選育，于2015年通過國家農(nóng)作物品種審定委員會審定，審定編號：國審玉2015017，該品種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病性強，適合黃淮海地區(qū)夏播，該品種籽粒脫水速率一般，在籽粒乳線消失之后適時收獲可以增加產(chǎn)量。

1.2 試驗設計

試驗材料于2018年6月18日播種于河南省農(nóng)業(yè)科學院研究與示范試驗基地(原陽)，該地屬暖溫帶大陸性季風氣候。供試土壤為潮土，地勢平坦，肥力均勻，排灌方便，試驗田前茬作物為小麥，常規(guī)田間管理。0～30 cm耕層土壤有機質(zhì)含量17.25 g/kg、全氮含量0.96 g/kg、速效氮含量 79.35 mg/kg、有效磷含量10.22 mg/kg、速效鉀含量94.56 mg/kg。

DK517和ZD1002的種植密度均為67 500株/hm2，60 cm等行距種植，每個處理3個重復，共12個小區(qū)。8月3-4日抽雄，在吐絲之前，每小區(qū)標記生長一致、無病蟲害的代表性植株并進行雌穗套袋，8月5-6日授粉，8月9日算作灌漿啟動。用0.08‰外源ABA(ABA80)(0.5%(V/V)Tween-20作為展開劑)進行噴施，分別于8月6，14，16日(均為晴天)16：00-17：00對穗位葉和穗部進行噴施；對照 (CK)套袋授粉后正常生長。

1.3 取樣材料

灌漿14 d后(8月22日)開始取樣，每個樣本由5株長勢較為一致的玉米穗位葉混合組成，生物學重復3次，命名為：DK518-ABA80-1、DK518-ABA80-2、DK518-ABA80-3；DK518-CK-1、DK518-CK-2、DK518-CK-3；ZD1002-ABA80-1、ZD1002-ABA80-2、ZD1002-ABA80-3；ZD1002-CK-1、ZD1002-CK-2、ZD1002-CK-3。取樣后立即放于液氮中，然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

按照RNeasy plant mini kit(Qiagen，Germany) 試劑盒操作步驟提取上述樣本總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗總RNA的完整性，用Agilent Bioanalyzer 2100 system(Aglilent Technologies，USA)生物芯片分析檢測儀檢測所提RNA的質(zhì)量，并用Nanodrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer (Nanodrop Technologie，USA) 定量檢測所提RNA的濃度。將檢測合格的RNA 樣本送至北京百邁客生物科技有限公司構建cDNA文庫，然后用Illumina HiSeqTM2500測序儀進行高通量測序，結果序列為pair-end序列。

1.5 基因功能注釋

通過去除接頭序列、低質(zhì)量序列、多N序列及長度過短序列，對測序原始序列進行質(zhì)量控制得到干凈序列，并計算測序堿基錯誤率及GC堿基含量。利用Hisat 2序列比對軟件，采用BWT算法將所得干凈序列與參考基因組B73序列(https：//www.maizegdb.org/)進行比對。利用RSeQC-2.6.3軟件對比對所得基因進行測序飽和度、基因覆蓋度及冗余序列分析后，參照蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫Nr (NCBI non-redundant protein sequences)、核酸序列數(shù)據(jù)庫Nt (NCBI non-redundant nucleotide sequence)、蛋白質(zhì)家族集合數(shù)據(jù)庫Pfam (Protein family)、真核生物蛋白相鄰類聚簇數(shù)據(jù)庫KOG/COG (Clusters of orthologous groups of proteins)、蛋白質(zhì)序列詳細信息數(shù)據(jù)庫Swiss-Prot (A manually annotated and reviewed protein sequence database)、京都基因組數(shù)據(jù)庫KO (KEGG orthology database)、基因本體論聯(lián)合會建立的基因相關信息數(shù)據(jù)庫GO(Gene ontology)等公共數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋。

1.6 篩選差異表達基因

在轉(zhuǎn)錄組測序分析中用R(F)PKM值(每1 000 000條序列中每個基因以1 000個堿基為單位，比對上的序列數(shù)量)衡量基因表達水平。依據(jù)基因數(shù)量并用edgeR軟件計算差異表達基因(P<0.05)。顯著差異表達基因篩選標準為基因錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR<0.05 &基因表達量差異倍數(shù)的對數(shù)值|log2FC|≥2。之后參照GO數(shù)據(jù)庫，將差異基因按照生物學過程(Biological process)、分子功能(Molecular function)、細胞組分(Cellular component)三大類對基因功能進行進一步詳細的分類。參照KEGG ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes) 數(shù)據(jù)庫分析差異表達基因參與的代謝途經(jīng)。

2 結果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結果統(tǒng)計

12個樣本全轉(zhuǎn)錄組高通量測序共獲得90.71 Gb干凈序列，各樣品干凈序列均達到6.09 Gb，堿基質(zhì)量值(Q30)在91.41%及以上，分別將各樣品的干凈序列與參考基因組B73序列進行比對，比對效率為84.69%～90.06%。基于序列比對結果，進行可變剪接預測分析、基因結構優(yōu)化分析以及新基因的發(fā)掘，發(fā)掘新基因7 998個，其中6 444個得到功能注釋。

表1詳細統(tǒng)計了12個樣品的測序結果。DK517-ABA80-1原始測序經(jīng)過質(zhì)量剪切過濾后獲得了49 659 930 條干凈序列，GC含量為55.02%，沒有AT/GC分離現(xiàn)象，Q30值達91.75%；利用Hisat2序列比對軟件與參照B73基因組比對，88.42%的序列配對成功，獲得43 908 042條配對序列。

DK517-CK-1原始測序經(jīng)過質(zhì)量剪切過濾后獲得了49 337 744條干凈序列，GC含量為55.95%，沒有AT/GC分離現(xiàn)象，Q30值達92.66%；利用Hisat2序列比對軟件與參照B73基因組比對，88.68%的序列配對成功，獲得43 754 859條配對序列。其余樣本的測序結果詳見表1。由表1可見，測序結果比較可靠。

表1 12個外源ABA處理穗位葉樣本轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量統(tǒng)計表Tab.1 Statistics of transcriptome data of 12 ear-samples treated by ABA

2.2 外源ABA處理相關差異表達基因統(tǒng)計

外源ABA處理后，將不同樣本中表達水平存在顯著差異的基因命名為差異表達基因(DEG)。DEG可以劃分為上調(diào)基因(Up-regulated gene)和下調(diào)基因(Down-regulated gene)。用R(F) PKM衡量比對到的基因表達量。12個測序樣本分成3個對比組進行分析，用A VS B表示，由圖1可見，DK517外源ABA處理材料與正常生長條件材料對比組(DK517-ABA80 VS DK517-CK，下同)差異表達基因共檢測到1 732個DEG，其中1 251個為上調(diào)表達基因，481個為下調(diào)表達基因；DK517中上調(diào)表達基因個數(shù)占總差異表達基因個數(shù)的72.23% 。另外，檢測到36 490個表達差異不顯著的基因。ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK差異表達基因檢測到52個DEG，其中24個為上調(diào)表達基因，28個為下調(diào)表達基因；ZD1002中上調(diào)表達基因占總差異表達基因的46.15%。另外，檢測到38 917個表達差異不顯著的基因。DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80差異表達基因共檢測到3 867個DEG，其中1 946個為上調(diào)表達基因，1 921個為下調(diào)表達基因；另外，檢測到36 265個表達差異不顯著的基因。

每個圓點表示1個基因，橫坐標表示某個基因在兩樣品中表達量差異倍數(shù)的對數(shù)值；橫坐標絕對值越大,說明表達量在兩樣品間的表達量倍數(shù)差異越大；縱坐標表示基因表達量變化的統(tǒng)計學顯著性的負對數(shù)值?？v坐標值越大，表明差異表達越顯著，篩選得到的差異表達基因越可靠。

2.3 外源ABA處理相關差異表達基因類別分析

參照GO數(shù)據(jù)庫結構化的標準生物學注釋系統(tǒng)，按照生物學過程、分子功能、細胞組分3個主要分支統(tǒng)計3個測序樣本組中DEG的GO分類情況。DK517-ABA80 VS DK517-CK差異表達基因主要富集于細胞凋零、生物節(jié)奏過程、單有機體過程、多有機體過程、繁殖過程、復制、多細胞有機體過程、發(fā)育過程、細胞成分組織或生物合成、生物調(diào)控、刺激反應、細胞過程、代謝過程、定位、信號、免疫系統(tǒng)過程、生長、生物階段、脫毒19個不同生物學過程分類；細胞成分、細胞、細胞器、細胞膜、細胞器成分、大分子復合體、細胞外區(qū)成分、細胞膜成分、細胞連接、超大分子復合體、細胞外區(qū)、膜封閉內(nèi)腔12個不同細胞組分分類；結合、催化活性、運輸活性、核酸結合轉(zhuǎn)錄因子活性、結構分子活性、電子載體活性、分子功能調(diào)節(jié)因子、信號傳遞活性、抗氧化活性、分子傳遞活性、營養(yǎng)儲備活性、轉(zhuǎn)錄因子活性及蛋白質(zhì)結合12個不同分子功能分類。ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK差異表達基因主要富集于單有機體過程、多細胞有機體過程、繁殖過程、復制、多有機體過程、發(fā)育過程、細胞成分組織或生物合成、生物調(diào)控、刺激反應、細胞過程、代謝過程、定位、生長13個不同生物學過程分類；細胞成分、細胞、細胞器、細胞膜、細胞器成分、大分子復合體、細胞外區(qū)成分、細胞膜成分、細胞連接、膜封閉內(nèi)腔10個不同細胞組分分類；結合、催化活性、電子載體活性、營養(yǎng)儲備活性4個不同分子功能分類。DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80差異表達基因主要富集于單有機體過程、運動、多有機體過程、繁殖過程、復制、多細胞有機體過程、發(fā)育過程、細胞成分組織或生物合成、生物調(diào)控、刺激反應、細胞過程、代謝過程、定位、信號、免疫系統(tǒng)過程、生長、生物階段、脫毒18個不同生物學過程分類；細胞成分、細胞、細胞器、細胞膜、細胞器成分、大分子復合體、細胞外區(qū)成分、細胞膜成分、細胞連接、超大分子復合體、細胞外區(qū)、膜封閉內(nèi)腔12個不同細胞組分分類；結合、催化活性、運輸活性、核酸結合轉(zhuǎn)錄因子活性、結構分子活性、電子載體活性、分子功能調(diào)節(jié)因子、信號傳遞活性、抗氧化活性、分子傳遞活性、營養(yǎng)儲備活性、轉(zhuǎn)錄因子活性及蛋白質(zhì)結合12個不同分子功能分類。

參照COG數(shù)據(jù)庫對檢測到的差異表達基因產(chǎn)物進行直系同源分類。DK517-ABA80 VS DK517-CK差異表達基因主要分布于染色體結構及動態(tài)變化過程、能量產(chǎn)生及儲存、細胞循環(huán)控制細胞分裂及染色體分區(qū)、氨基酸轉(zhuǎn)運及代謝、核苷酸轉(zhuǎn)運及代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運及代謝、輔酶轉(zhuǎn)運及代謝、脂類轉(zhuǎn)運及代謝、翻譯核糖體結構及生物合成、轉(zhuǎn)錄、復制修復及重組、細胞壁細胞膜及被膜生物合成、細胞運動、翻譯后修飾蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)及分子伴侶、無機離子運輸及代謝、次級代謝物生物合成運輸及分解代謝、通用功能預測、未知功能、信號傳導機制、胞內(nèi)運輸分泌及膜泡運輸、防衛(wèi)機制、細胞骨架、細胞外結構23個不同COG數(shù)據(jù)庫分類。ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK差異表達基因主要分布于細胞循環(huán)控制細胞分裂及染色體分區(qū)、氨基酸轉(zhuǎn)運及代謝、翻譯核糖體結構及生物合成、細胞壁細胞膜及被膜生物合成、翻譯后修飾蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)及分子伴侶、次級代謝物生物合成運輸及分解代謝、通用功能預測、防衛(wèi)機制8個不同COG數(shù)據(jù)庫分類。DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA差異表達基因的COG數(shù)據(jù)庫分類與DK517-ABA80 VS DK517-CK相似，僅少了1個染色體結構及動態(tài)COG數(shù)據(jù)庫分類，但同一COG數(shù)據(jù)庫分類中富集到的差異表達基因數(shù)目不同。

生物體內(nèi)不同基因產(chǎn)物往往相互協(xié)調(diào)而行使生物學功能。因此，對差異表達基因的代謝途徑(Pathway)進行注釋分析可進一步了解基因功能。KEGG數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)分析基因功能及基因組信息的數(shù)據(jù)庫，把基因和表達信息作為一個整體網(wǎng)絡進行研究。KEGG數(shù)據(jù)庫包括碳水化合物、核苷酸、氨基酸等代謝及有機物的生物降解。圖2-4展示了3個對比組差異表達基因KEGG注釋結果通路類型分類。DK517-ABA80 VS DK517-CK差異表達基因注釋到100個不同代謝通路中，其中富集到的差異表達基因≥10的代謝通路主要有植物激素信號傳導、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工過程、DNA復制、同源重組、不匹配修復、核苷酸切除修復、核糖體、真核細胞中核糖體合成、天冬氨酸及谷氨酸代謝、半胱氨酸及蛋氨酸代謝、纈氨酸亮氨酸及異亮氨酸降解、果糖及甘露糖代謝、糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝、淀粉及蔗糖代謝、光合器官中碳固定、光合作用、氨基酸生物合成、碳水化合物代謝、谷胱甘肽代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝(圖2)。其中，尤其值得注意的是植物激素信號傳導系統(tǒng)通路，共富集22個差異表達基因，如表2所示。

縱坐標為KEGG代謝途徑名稱；橫坐標為注釋到該通路下的基因個數(shù)及其個數(shù)占被注釋上的基因總數(shù)的比例。圖3-4同。The ordinate is KEGG metabolic pathway；The abscissa is gene numbers annotated to the pathway and the proportion of gene numbers annotated to the total number of genes annotated.The same as Fig.3-4.

表2 DK517-ABA80 VS DK517-CK植物激素信號傳導通路中共同差異表達基因Tab.2 List of DEGs in plant hormone signal transduction pathway in DK517-ABA80 VS DK517-CK group

由圖3可以看出，ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK差異表達基因注釋到12個不同代謝通路中，每個代謝通路只有1個差異表達基因。12個不同的代謝通路分別為蛋白酶體、RNA降解、核苷酸切除修復、基礎轉(zhuǎn)錄因子、丙氨酸天冬氨酸及谷氨酸代謝、精氨酸生物合成、氨基酸及核苷酸代謝、果糖及甘露糖代謝、光合器官中碳固定、氨基酸生物合成、碳代謝、2-氧化羧酸代謝通路。

圖3 外源ABA處理后ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK對比組差異表達基因KEGG分類圖Fig.3 DEGs KEGG taxonomic map of ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK group treated by ABA

由圖4可以看出，DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80差異表達基因注釋到107個不同代謝通路中，其中富集到的差異表達基因≥10的代謝通路主要有內(nèi)吞作用、過氧化物酶體、激酶信號系統(tǒng)、植物激素信號傳導、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工過程、RNA降解、泛素介導的蛋白質(zhì)水解、DAN復制、同源重組、不匹配修復、核苷酸修復、接合體、RNA轉(zhuǎn)運蛋白、核糖體、真核細胞中核糖體合成、mRNA監(jiān)測途徑、半胱氨酸及蛋氨酸代謝、苯丙醇生物合成、氨基酸及核苷酸代謝、檸檬酸循環(huán)、果糖及甘露糖代謝、糖酵解/糖異生、乙醛酸及二羧酸酯代謝、淀粉及蔗糖代謝、光合器官中碳固定、氨基酸生物合成、碳水化合物代謝、脂肪酸代謝、甘油脂類代謝、谷胱甘肽代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝、植物病原體相互作用通路。植物激素信號傳導系統(tǒng)通路中共富集24個差異表達基因(表3)。

圖4 外源ABA處理后DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80對比組差異表達基因KEGG分類圖Fig.4 DEGs KEGG taxonomic map of DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80 group treated by ABA

表3 DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80植物激素信號傳導通路中共同差異表達基因Tab.3 List of DEGs in plant hormone signal transduction pathway in DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80 group

2.4 外源ABA處理相關轉(zhuǎn)錄因子分析

DK517及ZD1002穗位葉噴施外源ABA后，轉(zhuǎn)錄組測序后進行轉(zhuǎn)錄因子分析，獲得多個重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，結果如圖5所示，主要有AGC蛋白激酶家族、AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族、AUX/IAA轉(zhuǎn)錄因子家族、B3轉(zhuǎn)錄因子家族、ARID轉(zhuǎn)錄因子、Alfin-like轉(zhuǎn)錄因子、Aur轉(zhuǎn)錄因子家族、BBR-BPC轉(zhuǎn)錄因子家族、BES1轉(zhuǎn)錄因子、BUB轉(zhuǎn)錄因子、C2C2-CO-like轉(zhuǎn)錄因子。在本研究中檢測到51個差異表達基因含有AGC類轉(zhuǎn)錄因子家族。檢測到193個差異表達基因含有AP2/ERF-ERF轉(zhuǎn)錄因子，24個差異表達基因含有AP2/ERF-AP2轉(zhuǎn)錄因子，5個差異表達基因含有AP2/ERF-RAV轉(zhuǎn)錄因子。檢測到53個差異表達基因含有AUX/IAA類轉(zhuǎn)錄因子家族。檢測到91個差異表達基因含有B3類轉(zhuǎn)錄因子家族。

2.5 外源ABA對不同品玉米種脫水速率相關基因的影響

圖6 對比分析了外源ABA對不同玉米品種脫水速率相關基因的影響。DK517-ABA80 VS DK517-CK(G1對比組)、ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK(G3對比組)共檢測到了10個共同差異表達基因，分別為：Zm00001d035000，在G1對比組中上調(diào)表達而在G3對比組中下調(diào)表達，在玉米中表達未標記蛋白LOC100279096；Zm00001d042063，在G1、G3對比組中均呈上調(diào)表達，玉米植株中表達假設蛋白 ZEAMMB73；Zm00001d045314，在G1對比組中上調(diào)表達而在G3對比組中下調(diào)表達，在玉米中表達S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶；Zm00001d003938，在G1對比組上調(diào)表達而在G3對比組下調(diào)表達，在玉米中表達甾醇皂苷；Zm00001d028647，在G1對比組中呈上調(diào)表達而在G3對比組中呈下調(diào)表達，在玉米中表達未標記蛋白LOC100280456；Zm00001d029778，在G1對比組中呈上調(diào)表達而在G3對比組中呈下調(diào)表達，在玉米植株中表達EC蛋白同系物；Zm00001d032186，在G1、G3對比組中均呈上調(diào)表達，在玉米植株中表達未標記蛋白LOC100192110前體；Zm00001d033447，在G1對比組中呈上調(diào)表達而在G3對比組中呈下調(diào)表達，功能未知；Zm00001d037988，在G1對比組中呈上調(diào)表達而在G3對比組中呈下調(diào)表達，在玉米植株中表達EMB564蛋白；Zm00001d046065，在G1對比組中呈上調(diào)表達而在G3對比組中呈下調(diào)表達，在玉米植株中表達組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶B催化亞體。G1對比組中存在1 722個特異的差異表達基因；G3對比組中存在42個特異的差異表達基因。

圖5 外源ABA處理不同玉米材料中轉(zhuǎn)錄因子分析結果Fig.5 Transcription factor analysis map of different material groups treated with exogenous ABA

G1.DK517-ABA80 VS DK517-CK；G2.DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80；G3.ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK。

G1對比組與DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80(G2對比組)共檢測到了268個共同差異表達基因；G1對比組中存在1 464個特異的差異表達基因，G2對比組中存在3 599個特異的差異表達基因。

G2對比組與G3對比組中共檢測到了15個共同差異表達基因，分別為：Zm00001d035000，在G1對比組中上調(diào)表達而在G3對比組中下調(diào)表達，在玉米中表達未標記蛋白LOC100279096；Zm00001d042063，在G1對比組中下調(diào)表達而在G3對比組中上調(diào)表達，在玉米中表達假設蛋白 ZEAMMB73；Zm00001d045314，在G1對比組中上調(diào)表達而在G3對比組中下調(diào)表達，在玉米中表達S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶；Zea_mays_newGene_10770，在G2對比組中上調(diào)表達而在G3對比組中下調(diào)表達，在玉米中表達假設蛋白E3泛酸蛋白連接酶SIS3；Zea_mays_newGene_18254、Zea_mays_newGene_20460均在G2對比組中上調(diào)表達而在G3對比組中下調(diào)表達，功能未知；Zea_mays_newGene_21290，在G2對比組中上調(diào)表達而在G3對比組中下調(diào)表達，玉米植株中表達未標記蛋白LOC109940605；Zm00001d003872在G2對比組中下調(diào)表達而在G3對比組中上調(diào)表達，玉米植株中表達未標記蛋白LOC100280055 異構體 X1；Zm00001d009259，在G2對比組中上調(diào)表達而在G3對比組中下調(diào)表達，在玉米植株中表達絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RUNKEL；Zm00001d011419，在G2對比組中下調(diào)表達而在G3對比組中上調(diào)表達，在玉米植株中表達細胞色素P450 72A15；Zm00001d017019，在G2對比組中下調(diào)表達而在G3對比組中上調(diào)表達，在玉米植株中表達ATFP4蛋白；Zm00001d024522，在G2對比組中下調(diào)表達而在G3對比組中上調(diào)表達，在玉米植株表達bHLH轉(zhuǎn)錄因子；Zm00001d028374，在G2對比組中下調(diào)表達而在G3對比組中上調(diào)表達，在玉米植株中表達早期真菌誘導蛋白CMPG1；Zm00001d032658，在G2對比組中下調(diào)表達而在G3對比組中上調(diào)表達，在玉米植株中表達假設蛋白ZEAMMB73_Zm00001d032658；Zm00001d034413，在G2對比組中上調(diào)表達而在G3對比組中下調(diào)表達，在玉米植株中表達球蛋白2前體。G2對比組中存在3 852個特異的差異表達基因；G3對比組中存在37個特異的差異表達基因。

ABA影響玉米籽粒灌漿速率及脫水速率。對檢測到的差異表達基因GO分類分析后獲得73個DEG與水分代謝相關，推測這些基因正是作為外源ABA調(diào)控的下游基因起作用，具體見表4。

表4 DK517和ZD1002葉片中與水分代謝通路相關的差異表達基因篩選Tab.4 List of DEGs which is related with water metabolism pathway in DK517 and ZD1002 leaf samples

3 結論與討論

在花粒期對籽粒不同脫水速率玉米品種DK517、ZD1002噴施外源ABA，對12個穗位葉樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)脫水速率較快的品種DK517在噴施外源ABA后有1 732個基因的表達水平達到顯著差異水平，其中1 251個上調(diào)表達，481個下調(diào)表達。脫水速率較慢的品種ZD1002在噴施外源ABA后只有52個基因的表達水平達到顯著差異水平，其中24個上調(diào)表達，28個下調(diào)表達。DK517中有更多參與ABA調(diào)控籽粒脫水過程的基因在表達水平上發(fā)生了顯著變化，推測正是這些基因共同作用加快了籽粒脫水速率，使得DK517適宜機收。DK517中上調(diào)表達基因個數(shù)占總差異表達基因個數(shù)的72.23%，ZD1002中上調(diào)表達基因占總差異表達基因的46.15%，遠低于DK517中上調(diào)表達基因所占比例。

DK517差異表達基因GO分析結果主要富集于19個不同生物學過程分類、12個不同細胞組分分類、12個不同分子功能分類；主要分布于染色體結構及動態(tài)變化過程等23個COG 數(shù)據(jù)庫分支；注釋到100個不同代謝通路中。ZD1002差異表達基因GO分析結果主要富集于13個不同生物學過程分類、10個不同細胞組分分類、4個不同分子功能分類；主要分布于細胞循環(huán)控制細胞分裂及染色體分區(qū)等8個COG 數(shù)據(jù)庫分支；注釋到12個不同代謝通路中。由此推測，不同玉米籽粒脫水速率品種中外源ABA調(diào)控的內(nèi)在分子機制不同。

轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中廣泛存在的能與DNA特異性結合的蛋白質(zhì)因子，其通過與順式作用元件特異性結合調(diào)控下游基因表達，參與植物生長發(fā)育過程中眾多的生物學功能。AGC蛋白激酶家族由一系列在結構和功能上相關的激酶組成，包含蛋白激酶A、蛋白激酶G、蛋白激酶C，共有63個家族成員，與細胞內(nèi)許多信號通路相關[27]。本研究中，共檢測到51個差異表達基因含有AGC類轉(zhuǎn)錄因子家族。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛存在于植物中，含有保守的AP2/ERF結構域。根據(jù)該結構域內(nèi)序列的相似性和AP2/ERF結構域的數(shù)量，可以將植物AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子分成DREB (Dehydration-responsive element binding protein)、ERF (Ethylene-responsive element binding factors)、 AP2 (APETALA 2)、RAV (Related to ABI3/VP1)和其他類別等5個亞家族[28]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物學過程，包括干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫響應等。在植物受到逆境刺激后，脫落酸、乙烯等信號相應被激活，并激活AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而調(diào)控功能基因的表達。本研究中，共檢測到193個差異表達基因含有AP2/ERF-ERF轉(zhuǎn)錄因子，24個差異表達基因含有AP2/ERF-AP2轉(zhuǎn)錄因子，5個差異表達基因含有AP2/ERF-RAV轉(zhuǎn)錄因子。AUX/IAA為生長素調(diào)節(jié)類轉(zhuǎn)錄因子。生長素水平和生長素信號通路調(diào)控系統(tǒng)對植物防御網(wǎng)絡有重要作用，生長素也可以直接作為抗菌活性的防御分子參與植物免疫反應過程的調(diào)節(jié)。生長素信號傳導主要受到AUX/IAA和生長素響應因子(ARFs)2類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。ARFs具有能夠與DNA結合的區(qū)域，可以與生長素響應基因啟動子中的生長素響應元件結合，激活生長素響應基因的表達。在不含有生長素或生長素濃度很低的環(huán)境下，AUX/IAA蛋白能與ARFs結合，使其不能激活下游生長素響應基因的表達；當生長素濃度升高時，生長素能夠促進AUX/IAA蛋白的泛素化降解，解除其對ARFs的抑制作用，從而使下游生長素響應基因的表達被成功激活[29]。本研究中，共檢測到53個差異表達基因含有AUX/IAA類轉(zhuǎn)錄因子家族。B3轉(zhuǎn)錄因子家族在被子植物中廣泛存在，數(shù)目眾多，具有高度保守的B3-DNA結合結構域，分為ARF (Auxin responsefactor)、ABI3/VP1、HSI (High-level expression of sugar-inducible gene)、RAV (Related to ABI3/VP1)、REM(Reproductive meristem) 5個家族。其中，B3-ARF轉(zhuǎn)錄因子亞家族屬于生長素響應因子，主要參與生長素響應有關的植物生理功能。B3轉(zhuǎn)錄因子家族在植物激素的合成以及信號轉(zhuǎn)導、種子發(fā)育、開花調(diào)控、生物及非生物脅迫應答中發(fā)揮著重要作用[30]。本研究共檢測到91個差異表達基因含有B3類轉(zhuǎn)錄因子家族。