溫敏性水凝膠抑制間充質(zhì)干細胞凋亡并促進旁分泌及過表達FTH的細胞MRI的實驗研究

賴麗莎?郭媛?梁瑩瑩?胡曉俊?盧雄

【摘要】目的 探討過表達鐵蛋白重鏈（FTH）的間充質(zhì)干細胞（UE7T-13）進行體外MRI的可行性，并驗證溫敏性水凝膠HA-F127復合UE7T-13是否可抑制其凋亡、促進細胞因子分泌。方法 構(gòu)建攜帶FTH-綠色熒光蛋白（GFP）基因的慢病毒載體并感染UE7T-13，檢測感染后的GFP陽性率及FTH表達水平。同時，HA-F127復合FTH/UE7T-13，細胞計數(shù)試劑盒（CCK8法）檢測FTH慢病毒載體感染后和（或）水凝膠復合后的UE7T-13細胞增殖能力，并進行HA-F127復合FTH/UE7T-13的MRI。檢測HA-F127復合對過氧化氫（H2O2） 誘導UE7T-13細胞凋亡的影響，ELISA檢測IL-10、HGF含量。結(jié)果 FTH-GFP慢病毒載體可成功感染UE7T-13，48 h熒光顯微鏡觀察GFP表達率幾乎100%，F(xiàn)TH mRNA表達提高了3倍，F(xiàn)TH蛋白可隨著時間延長表達增多并至5 d仍穩(wěn)定高效表達。FTH感染或HA-F127復合均不影響UE7T-13增殖能力，不影響骨髓間充質(zhì)干細胞的體外MRI。HA-F127復合UE7T-13可抑制H2O2介導的細胞凋亡，并促進IL-10、HGF細胞因子分泌。結(jié)論 過表達FTH實現(xiàn)UE7T-13的MRI示蹤功能，溫敏性水凝膠HA-F127可在過氧化損傷環(huán)境下抑制FTH/UE7T-13的凋亡，并促進其分泌IL-10、HGF，可為下一步實驗奠定基礎。

【關鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細胞;鐵蛋白重鏈;水凝膠;磁共振成像;凋亡

Experimental study of role of thermo-sensitive hydrogel in inhibiting apoptosis and promoting paracrine function of MSC and MRI of MSC overexpressing FTH Lai Lisha， Guo Yuan， Liang Yingying， Hu Xiaojun， Lu Xiong. Department of Radiology， Guangzhou First Peoples Hospital， School of Medicine， South China University of Technology， Guangzhou 510180， China

Corresponding author， Lu Xiong， E-mail： 122055667@ qq. com

【Abstract】Objective To explore the feasibility of in-vitro magnetic resonance imaging （MRI） for UE7T-13 overexpressing ferritin heavy chain （FTH）， and investigate the role of thermo-sensitive hydrogel （HA-F127） in suppressing apoptosis and promoting paracrine function of UE7T-13. Methods Lentiviral vectors carrying FTH-GFP gene were established and transfected into UE7T-13. The positive rate of GFP expression and FTH expression level in FTH/UE7T-13 cells were evaluated. FTH/UE7T-13 was encapsulated in HA-F127. Cell Counting Kit-8 （CCK-8） was used to detect the cell proliferation of UE7T-13 after transfection and encapsulation. MRI of the HA-F127-encapsulated FTH/UE7T-13 was performed. The effect of HA-F127 upon the H2O2-induced UE7T-13 apoptosis was evaluated. The contents of IL-10 and HGF were quantitatively measured by using ELISA. Results Lentiviral vectors carrying FTH-GFP gene were successfully transfected into UE7T-13. Fluorescent microscope revealed that the GFP expression rate was almost 100% at 48 hours and the expression level of FTH mRNA was up-regulated by three times. The expression of FTH protein was up-regulated over time and stably expressed for 5 days after transfection. FTH transfection and HA-F127 encapsulation exerted no effect on the proliferation ability of UE7T-13 or the MRI of mesenchymal stem cell. HA-F127 encapsulation could inhibit cell apoptosis induced by H2O2 and promote HGF and IL-10 secretion. Conclusions FTH over-expression can realize in-vitro MRI of UE7T-13. Thermo-sensitive hydrogel HA-F127 encapsulation can inhibit the apoptosis and enhance the HGF and IL-10 secretion of FTH/UE7T-13， which lay a basis for subsequent experiment.

【Key words】Mesenchymal stem cell;Ferritin heavy chain;Hydrogel;Magnetic resonance;

Apoptosis

我國慢性乙型肝炎患者約2000萬，每年死于肝纖維化和肝癌的患者高達50萬，是全球晚期肝病發(fā)病率最高的地區(qū)[1]。目前尚無有效治療肝纖維化的臨床方法，間充質(zhì)干細胞（MSC）被認為具有修復肝纖維化的潛能[2]。前期實驗表明，體內(nèi)微環(huán)境影響MSC存活率，并且缺乏活體監(jiān)測MSC的有效手段是阻礙MSC治療從基礎研究向臨床移植治療轉(zhuǎn)化的關鍵[3-4]。本研究擬構(gòu)建可活體MRI顯像的過表達鐵蛋白重鏈（FTH）的MSC（FTH/MSC），并體外證實其可實現(xiàn)MSC的MRI示蹤功能，同時，通過構(gòu)建功能化水凝膠（HA-F127）改善細胞外微環(huán)境，以提高MSC的存活率及旁分泌功能，為下一步實驗奠定基礎。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

DMEM-LG 培養(yǎng)基（GIBCO），F(xiàn)TH基因質(zhì)粒（廣州永諾生物科技有限公司），CCK-8細胞計數(shù)試劑盒（日本同仁化學研究所），HGF、IL-10 ELISA試劑盒（RD公司），兔抗人FTH單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體（武漢博士德公司）。熒光顯微鏡（奧特BDS200-FL），酶標儀（Diatek公司），冷凍高速離心機（Hema TGL-16R），1.5T 磁共振成像儀（Signa Infinity Twinspeed，GE公司）。人永生化骨髓MSC UE7T-13（日本Mori等[5]惠贈）：5%二氧化碳（CO2），37℃環(huán)境下，低糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)（圖1）。

二、慢病毒載體構(gòu)建、病毒感染及基因表達檢測

通過PCR進行FTH基因和IRES-綠色熒光蛋白（GFP）基因擴增，將二者連接后，與慢病毒載體LV003相連，構(gòu)建LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒載體進行測序鑒定;同時構(gòu)建GFP慢病毒載體作為陰性對照（FTH/UE7T-13及GFP/UE7T-13）。采用脂質(zhì)體法將重組載體感染人胚腎細胞293A（HEK-293A）進行包裝，檢測病毒滴度（TU/ml）。

將5×105 UE7T-13接種至6孔板，感染前更換新鮮培養(yǎng)液，根據(jù)預實驗獲得的最佳感染復數(shù)（3000 pfu/細胞）加入病毒液，混勻后置于細胞培養(yǎng);于6 h更換新鮮培養(yǎng)液，每隔24 h觀察細胞狀態(tài)。

病毒感染后48 h，采用熒光顯微鏡觀察GFP表達情況;定量PCR（Q-PCR）方法檢測FTH mRNA水平，引物如下（FTH1-F：GACTCAGAG

GCCGCCATCAA;FTH1-R：AAGATTCGGCCA CCTCGTTG），使用2-ΔΔCt法[ΔCt = Ct（FTH） -Ct（GAPDH），△△Ct = Ct（FTH/UE7T-13） -Ct（UE7T-13）];采用蛋白免疫印跡法檢測FTH慢病毒感染UE7T-13后1、2、3、5 d的FTH蛋白表達。

三、體外細胞MRI

分別將不同數(shù)量（1×103、1×104、1×105、1× 106、1×107、1×108）FTH/UE7T-13細胞進行體外MRI掃描。掃描方案：1.5 TMR，并采用內(nèi)徑12.7 cm的表面線圈，進行SE序列T2W掃描，參數(shù)：重復時間= 400 ms，回波時間= 100 ms，帶寬20.83，NEX = 2.0，F(xiàn)OV = 20 cm×20 cm，層厚2 mm，矩陣384×256。

四、溫敏水凝膠透明質(zhì)酸（HA） -F127的制備、鑒定并復合FTH/UE7T-13

稱取0.9 g的普朗尼克（Pluronic）F127分別和0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g 透明質(zhì)酸鈉混合，配制成質(zhì)量分數(shù)為18%及分別含有不同濃度（1%、2%、2.3%、2.5%、3%、4%、5%）HA-F127溶液，使其可在37℃凝膠，成膠后采用掃描電鏡觀察凝膠（HA-F127）的三維結(jié)構(gòu)。

收集生長狀態(tài)良好的第3 ～ 5代慢病毒感染后UE7T-13，消化、離心后，用未凝固的水凝膠混合液重懸細胞沉淀，UE7T-13與HA-F127充分混合后，置于5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，待凝固成膠體后，每孔再添加 200 μl含10%胎牛血清和1% 鏈霉素的 DMEM 細胞培養(yǎng)基。

細胞實驗根據(jù)處理情況共分4組：A組（UE7T- 13），未感染的UE7T-13;B組（GFP/UE7T-13），空白載體載GFP感染的UE7T-13;C組（FTH/UE7T-13），F(xiàn)TH慢病毒感染的UE7T-13;D組（GEL-FTH/UE7T-13），HA-F127復合的FTH/UE7T-13，即凝膠組。

五、HA-F127復合及FTH感染對UE7T-13的成脂成骨分化能力檢測

D組（GEL-FTH/UE7T-13）需先放入4℃冰箱中溶解凝膠，凝膠溶解后去除，并使用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）進行清洗，分別向培養(yǎng)板內(nèi)加入成脂、成骨誘導分化培養(yǎng)基，分別采用油紅O染色、茜素紅染色，顯微鏡下觀察標記后MSC的成脂、成骨分化情況。

六、CCK-8檢測HA-F127復合FTH/UE7T-13的增殖率

4個處理組各取5×103個細胞，均勻接種于96孔板，于接種后第3日進行CCK-8，檢測細胞增殖情況，以A組（UE7T-13）作為對照組，每次每組設3個復孔，取平均值。

七、HA-F127復合FTH/UE7T-13抗過氧化氫（H2O2）誘導細胞凋亡及促進細胞因子釋放的檢測

將C、D組細胞接種于6孔板，24 h后加入H2O2（50 μmol/L），調(diào)整終濃度為50 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12 h;培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞進行流式凋亡檢測。采用ELISA檢測C組及D組上清液的肝細胞生長因子（HGF）、IL-10濃度：分別將2組5×105個細胞接種于6孔板，24 h后加入H2O2（50 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取細胞上清液檢測HGF、IL-10水平。

八、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示。兩獨立樣本采用t檢驗進行組間比較。多組比較采用單因素方差分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、成功構(gòu)建LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒載體并轉(zhuǎn)染UE7T-13

LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒載體，并成功感染UE7T-13。感染293A 48 h后，細胞免疫法檢測病毒滴度為1×109 TU/ml。FTH慢病毒感染UE7T-13 48 h后熒光顯微鏡下觀察，GFP表達陽性率幾乎100%（圖2A）;Q-PCR證實FTH慢病毒感染UE7T-13 48 h后FTH mRNA表達水平提高了3倍（P < 0.001）;FTH慢病毒感染UE7T-13，F(xiàn)TH蛋白表達隨著感染時間延長增多。

二、HA-F127可成功復合MSC，不影響細胞增殖能力

當F127濃度為18%，HA濃度為2.3%，HA-F127可在37℃凝固成膠（圖3A）。CCK-8顯示，4組細胞生長增殖情況比較差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.809，圖3B）。HA質(zhì)量分數(shù)與凝膠化溫度的關系見表1。

三、HA-F127復合FTH/UE7T-13的MRI

HA-F127復合FTH/UE7T-13后，利用FTH的T2負性對比效應，可檢測MSC的T2負性對比，在磁共振T2加權圖像上呈低信號。并且隨著細胞數(shù)量的增加，MRI標準化信號強度逐漸降低（圖4）。

四、HA-F127復合FTH/UE7T-13不影響其成骨成脂分化能力

水凝膠包裹FTH/UE7T-13洗脫后進行成骨成脂誘導：①茜素紅染色顯示FTH/UE7T-13大片深紅色化合物，聚集部可見斑片狀橘紅色鈣鹽沉積（圖5A）;②油紅O染色顯示FTH/UE7T-13體積增大，胞漿內(nèi)可見串珠狀紅色脂滴（圖5B）。上述證明成骨成脂誘導成功。

五、HA-F127復合可抑制UE7T-13凋亡，并促進HGF及IL-10的旁分泌

經(jīng)H2O2處理12 h后，D組細胞早期凋亡率為5.7%，晚期凋亡率為13.9%，C組細胞早期凋亡率為7.2%，晚期凋亡率為21.7%，D組細胞凋亡數(shù)量少于C組（圖6A）。ELISA實驗證實，D組的上清液中HGF及IL-10分泌較C組增加（HGF：148.4±15.9 vs. 42.9±3.9，t = -11.1，P < 0.001;IL-10：49.51±5.4 vs. 21.2±2.6，t = -5.7，P = 0.005;圖6B）。

討論

干細胞移植治療終末期肝病越來越受到人們的關注[2]。然而，仍有研究指出MSC移植不能改善，甚至是促進肝纖維化，可能是肝纖維化體內(nèi)微環(huán)境導致MSC活性降低或者死亡[6-7]。因此，如何改善移植后微環(huán)境，提高MSC存活率及增強旁分泌能力，可能是提高MSC移植治療肝纖維化療效的關鍵。因此本研究采用HA-F127復合MSC改善細胞生長微環(huán)境，增強MSC在H2O2過氧化損傷環(huán)境中的存活及旁分泌功能;同時，通過MRI分子影像技術，實現(xiàn)MSC的活體示蹤的目的。

本實驗使用人永生化骨髓MSC（UE7T-13），具有無限增殖能力并維持良好的細胞狀態(tài)和功能，且同MSC一樣易于接受外源性基因的導入[5]。本研究選擇FTH的MRI報告基因?qū)崿F(xiàn)MSC活體示蹤的目的，因為其可利用內(nèi)源性鐵離子進行MRI，不依賴外源性鐵劑，具有相對更高的MRI靈敏度[8]。細胞基因?qū)氲霓D(zhuǎn)運載體選擇非常重要，本研究選擇慢病毒載體，可將大片段的目的基因整合靶細胞DNA，并使目的基因長時間穩(wěn)定表達，同時，其引起的免疫反應小[9-10]。構(gòu)建的LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒表達載體感染UE7T-13 48 h后，可同時表達FTH和GFP，熒光顯微鏡下可見GFP表達幾乎達100%，Q-PCR檢測提示感染細胞中FTH mRNA的表達提高了3倍，蛋白免疫印跡法顯示感染細胞中FTH可隨著時間延長表達增多，并至5 d仍穩(wěn)定高效表達，并被證實可用于MSC的體外MRI，這為下一步動物實驗提供成像基礎。

有研究者指出MSC治療肝纖維化療效欠佳，可能與肝纖維化微環(huán)境中存在的大量炎癥因子，直接導致移植的MSC大量逃逸和死亡有關[3-4， 6-7]。HA和Pluronic F127制備的水凝膠（HA-F127）不僅具有良好的生物相容性和安全性，還具有溫度敏感性，可用于常溫下注射，并在37℃呈凝膠狀，注射后能夠構(gòu)建MSC移植后生存的微環(huán)境，促進其滯留、存活及旁分泌等功能[11-13]。本研究證實，HA-F127在體外不影響FTH/UE7T-13的增殖能力，且不影響MSC的成脂成骨能力。

在H2O2誘導凋亡情況下，D組細胞凋亡率低于C組;同時證實在過氧化損傷情況下，D組細胞上清液中HGF及IL-10分泌較C組明顯增多。上述結(jié)果可能與HA-F127改善細胞存在的微環(huán)境，促進MSC的存活而進一步增加其旁分泌功能有關，同時，HGF及IL-10作為抗凋亡及抗炎因子也發(fā)揮了抗過氧化而減少細胞損傷作用[14-15]。

綜上所述，表達LV003-FTH-IRES-GFP慢病毒感染UE7T-13后可穩(wěn)定高效表達FTH，可用于MSC的體外MRI，而且不影響UE7T-13分化增殖能力;同時，HA-F127可通過改善UE7T-13的微環(huán)境從而抑制MSC凋亡，提高旁分泌能力。該結(jié)果為本課題組進一步開展水凝膠復合MSC治療肝纖維化提供了研究基礎。

參 考 文 獻

[1] Soriano V， Young B， Reau N. Report from the international Conference on Viral Hepatitis-2017. AIDS Rev，2018，20（1）：58-70.

[2] Guo Y， Chen B， Chen LJ， Zhang CF， Xiang C. Current status and future prospects of mesenchymal stem cell therapy for liver fibrosis. J Zhejiang Univ Sci B，2016，17（11）：831-841.

[3] Lai L， Chen J， Wei X， Huang M， Hu X， Yang R， Jiang X， Shan H. Transplantation of MSCs overexpressing HGF into a rat model of liver fibrosis. Mol Imaging Biol，2016，18（1）：43-51.

[4] Carvalho AB， Quintanilha LF， Dias JV， Paredes BD， Mann-heimer EG， Carvalho FG， Asensi KD， Gutfilen B， Fonseca LM， Resende CM， Rezende GF， Takiya CM， de Carvalho AC， Goldenberg RC. Bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells do not reduce fibrosis or improve function in a rat model of severe chronic liver injury. Stem Cells，2008，26（5）：1307-1314.

[5] Mori T， Kiyono T， Imabayashi H， Takeda Y， Tsuchiya K， Miyoshi S， Makino H， Matsumoto K， Saito H， Ogawa S， Sakamoto M， Hata J， Umezawa A. Combination of hTERT and bmi-1， E6， or E7 induces prolongation of the life span of bone marrow stromal cells from an elderly donor without affecting their neurogenic potential. Mol Cell Biol，2005，25（12）：5183-5195.

[6] Russo FP， Alison MR， Bigger BW， Amofah E， Florou A， Amin F， Bou-Gharios G， Jeffery R， Iredale JP， Forbes SJ. The bone marrow functionally contributes to liver fibrosis. Gastroenterology，2006，130（6）：1807-1821.

[7] Mohamadnejad M， Alimoghaddam K， Bagheri M， Ashrafi M， Abdollahzadeh L， Akhlaghpoor S， Bashtar M， Ghavamzadeh A， Malekzadeh R. Randomized placebo-controlled trial of mesenchymal stem cell transplantation in decompensated cirrhosis. Liver Int，2013，33（10）：1490-1496.

[8] Vandsburger MH， Radoul M， Cohen B， Neeman M. MRI reporter genes： applications for imaging of cell survival， proliferation， migration and differentiation. NMR Biomed，2013，26（7）：872-884.

[9] Lundstrom K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol，2003，21（3）：117-122.

[10] Vigna E， Naldini L. Lentiviral vectors： excellent tools for experimental gene transfer and promising candidates for gene therapy. J Gene Med，2000，2（5）：308-316.

[11] Ballios BG， Cooke MJ， Donaldson L， Coles BL， Morshead CM， van der Kooy D， Shoichet MS. A hyaluronan-based injectable hydrogel improves the survival and integration of stem cell progeny following transplantation. Stem Cell Reports， 2015，4（6）：1031-1045.

[12] Bumgardner GL， Gao D， Li J， Baskin JH， Heininger M， Orosz CG. Rejection responses to allogeneic hepatocytes by reconstituted SCID mice， CD4， KO， and CD8 KO mice. Trans-plantation，2000，70（12）：1771-1780.

[13] Hamrah P， Haskova Z， Taylor AW， Zhang Q， Ksander BR， Dana MR. Local treatment with alpha-melanocyte stimulating hormone reduces corneal allorejection. Transplantation，2009，88（2）：180-187.

[14] Thompson K， Maltby J， Fallowfield J， McAulay M， Millward-Sadler H， Sheron N. Interleukin-10 expression and function in experimental murine liver inflammation and fibrosis. Hepatology，1998，28（6）：1597-1606.

[15] T?gel F， Weiss K， Yang Y， Hu Z， Zhang P， Westenfelder C. Vasculotropic， paracrine actions of infused mesenchymal stem cells are important to the recovery from acute kidney injury. Am J Physiol Renal Physiol，2007，292（5）：F1626-F1635.

（收稿日期：2020-03-18）

（本文編輯：楊江瑜）