不同咀嚼負荷對牙周組織炎癥狀態影響的實驗研究

張博倫　賈如　胡波　裴丹丹　劉潔　韓如浩　逯宜

[摘要]目的：探討牙周炎狀態下不同咀嚼負荷對牙周組織的炎性狀態的影響。方法：取18只大鼠利用局部注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）+高糖飲食喂養方法建立實驗性動物牙周炎模型，36d后停止處置并隨機分為兩組：LPS組與LPS+soft組各9只，分別用正常飼料與定制軟飼料連續喂養7d，另取3只大鼠作為control組。43d后，采集雙側上頜第一磨牙腭側齦溝液與牙齦組織及磨牙區上頜骨，分別用于ELISA檢測、提取總RNA、反轉錄后進行Real-time PCR和用于Micro-CT掃描、三維重建后脫鈣進行H&E染色。結果：相比于control組，LPS+soft組和LPS組腭側牙槽骨均出現明顯吸收，炎細胞浸潤，破骨細胞增殖，形成骨吸收陷窩形成，其中LPS組更為明顯。LPS組IL-1β、TNF-α在牙齦組織的表達與齦溝液含量中分泌水平均高于control組，差異具有統計學意義（P<0.05）;牙齦組織中IL-6在LPS組的表達也顯著高于control組，差異具有統計學意義（P<0.05）;另外TNF-α在LPS組中的基因表達水平較LPS+soft組顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論：不同硬度的食物會導致牙周組織的炎癥反應程度出現差異，較軟食物相對正常食物有減輕其炎性狀態的作用。

[關鍵詞]牙周炎;牙列缺損;力學載荷;脂多糖;炎癥因子

[中圖分類號]R781.4+2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）08-0023-04

Effects of Inflammation for Periodontitis Tissue on Different Masticatory Loading

ZHANG Bo-lun，JIA Ru，HU Bo，PEI Dan-dan，LIU Jie，HAN Ru-hao，LU Yi

（Department of Prosthodontics，College of Stomatology，Xian Jiaotong University，Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research，Xian 710004，Shaanxi，China）

Abstract： Objective? To explore the effect of different mechanical loads on the inflammatory state of periodontitis tissue. Methods? 18 rats were taken to establish an experimental periodontitis model by local injection of LPS （Lipopolysaccharides） + high-sugar feeding method. After 36 days， the injection was stopped and the rats was divided randomly into two groups： the LPS group and the LPS+soft group， there were 9 rats in each group. The two groups were fed respectively with sufficient normal feed and customized soft feed for 7 days. Another 3 rats were taken as control group. After 43 days， the gingival crevicular fluid and the gingival tissue of the palatal side of the maxillary first molars were collected for ELISA detection， total RNA extraction， Real-time PCR after reverse transcription， the maxillary bone of the molar area were collected for H&E staining after Micro-CT scanning and 3D reconstruction. Results? Compared with the control group， the alveolar bone of the LPS+soft group and the LPS group showed obvious resorption， inflammatory cell infiltration， osteoclast proliferation， and Howships lacuna， in particular， the LPS group was more obvious. The expression of IL-1β and TNF-α in gingival tissue and secretion level of gingival crevicular fluid were higher in the LPS group than in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression of IL-6 in gingival tissue in the LPS group was higher than that in the control group （P<0.05）. In addition， the gene expression level of TNF-α in the LPS group was higher than that in the LPS+soft group （P<0.05）. Conclusion? Different hardness foods will lead to differences in the degree of inflammation of periodontal tissues， the softer foods have a role in reducing their inflammatory status compared to normal diets.

Key words： periodontitis; dentition defect; masticatory loading; lipopolysaccharide; inflammatory factors

牙周炎是口頜系統的常見疾病，為中老年人群牙齒缺失的首要原因[1]。在對患者進行固定或活動義齒修復時，通常需選擇余留牙作為基牙，咀嚼力經由基牙牙齒硬組織傳導到牙周膜和牙槽骨，進而引發牙周組織相應的生物化學反應。研究顯示，健康的牙槽骨在受到力學刺激后會發生成/破骨的雙向改變[2]，但對于炎性牙周組織在不同咀嚼負荷下的炎性改變在體研究尚未見報道。學者們常通過咬合早接觸誘導咬合創傷建立動物模型，而該方法會引起大鼠咬合痛[3-4]，并非生理狀態下的過大牙合力狀態。因此本課題擬利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）+高糖飲食構建大鼠牙周炎狀態，并利用不同硬度飼料加載不同大小的咀嚼負荷，檢測患牙牙周組織炎癥反應狀態，以探討牙周炎狀態下不同咀嚼負荷對牙周組織的炎性狀態的影響，從而對牙周炎患者的修復設計提供實驗依據與參考。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物及牙周炎受力載荷模型的建立：清潔級（SPF等級）、8～10周齡、雄性、SD（Sprague-Dawley）大鼠，21只，體質量（200±20）g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。

隨機選取18只大鼠，建立實驗性牙周炎在體模型，10%葡萄糖水喂養，3%異氟烷吸入麻醉下，在雙側上頜第一磨牙腭側近中齦溝、根分叉對應黏膜及第一、第二磨牙間齦乳頭3處位點分別使用微量進樣器注射3μl（濃度為10μg/μl）LPS，緩慢注射，并停留數秒，減少試劑流失，隔天注射，共18次。36d后停止注射LPS及10%葡萄糖水喂養，隨后將18只大鼠平均分成兩組，正常硬度飼料喂養組（LPS組）：9只，每日投食足量常規飼料（西安交通大學醫學院實驗動物中心），自由飲水，連續喂養7d;軟食喂養組（LPS+soft組）：9只，每日投食足量定制的軟飼料（西安飛揚生物科技有限公司），自由飲水，連續喂養7d。其余3只大鼠作為空白對照組（control組），同環境下繼續飼養不做處理，共43d。

1.2 主要實驗試劑和儀器：LPS（L-2880，10mg）（Sigma，美國）;異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）;Rat IL-1β、Rat TNF-α的ELISA試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）;15#吸潮紙尖（天津加發醫療器械有限公司）;輕簡型動物麻醉機（瑞沃德，深圳）;小動物活體Micro-CT（PerkinElmer，美國）。

1.3 標本采集：預備常用試驗器械以及15#吸潮紙尖，預先剪去0.5mm尖端消毒后置于150μl微離心管內，3根每瓶，稱重記錄備用。43d后取全部大鼠，3%異氟烷吸入麻醉下，參照文獻記載方法[5-6]，擦干腭側黏膜，使用紙尖采集大鼠雙側第一磨牙腭側齦溝液，每側取近中、正中和遠中3個位點共3支吸潮紙尖，置于150μl微離心管內稱重，設0.15mg：150μl的濃度為1，加入150μl相應倍數的ELISA試劑盒內自帶緩沖液稀釋，-80℃保存。隨后繼續于3%異氟烷吸入麻醉下斷頭處死所有大鼠，取雙側第一磨牙腭側牙齦組織，即刻液氮冷凍后置于凍存管內，-80℃保存，分離雙側磨牙區上頜骨標本，送Micro-CT掃描。

1.4 Micro-CT檢測：將所取得的各組大鼠雙側磨牙區上頜骨標本使用Micro-CT掃描、三維重建。分別在每個樣本腭側中部1mm區域內選擇近中、中央、遠中3個位點，間隔0.5mm，在Micro-CT二維圖像的冠狀位剖面進行測量，記錄每個樣本腭側牙槽嵴頂到咬合平面的距離并取平均數，以進行統計分析（見圖1）。

1.5 組織病理學觀察：將每個經過Micro-CT掃描后的標本用生理鹽水清洗后分置于4%多聚甲醛中固定24h，參照EDTA脫鈣液說明書，0.2mol/L磷酸緩沖液中充分漂洗，漂洗后投入10%成品脫鈣液脫鈣約1個月，至大頭針能刺入骨密質為止，經脫水后行石蠟包埋，選取相近位置分別做3～5μm近遠中向切片。隨機在LPS組、LPS+soft組中各選取4個樣本的切片，另在control組中隨機選擇2個標本的切片，進行H&E染色，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 分子生物學相關檢測：總RNA的提取及Real-time PCR反應：自-80℃冰箱中取出牙齦組織，放入液氮預冷的研缽中加入1ml的Trizol，充分勻漿后，按試劑盒說明提取總RNA及合成cDNA模板。對從RNA中獲得的cDNA進行qPCR，檢測各組樣本中白細胞介素（Interleukin，IL）1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及單核細胞趨化蛋白（Monocyte chemoattractant protein，MCP）1的mRNA表達。以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，對所得數據進行分析。各基因引物見表1。

IL-1β、TNF-α的ELISA檢測：實驗前從-80℃冰箱內取出微離心管恢復至室溫，輕柔渦旋振蕩洗脫1h，1 500r/min，4℃離心15min，提取100μl上清液備用。參考Rat IL-1β、Rat TNF-α Elisa試劑盒的說明書，將空白對照孔調零，使用酶標儀進行雙波長檢測，測定450nm最大吸收波長和570nm參考波長下的OD值。進行回歸分析確定最佳擬合曲線，通過樣本OD值在標準曲線上找到樣本對應濃度。

1.7 統計學分析：用SPSS 26.0軟件（IBM，美國）對所得計量資料進行分析，計量資料均數±標準差表示（精確至小數點后四位），多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態分布或方差不齊的數據采用Kruskal-Wallis檢驗，多組數據之間的多重比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2? 結果

2.1 牙槽骨吸收情況：Micro-CT掃描后進行三維重建，結果如圖2所示。可以看出與control組相比，LPS組與LPS+soft組均有明顯弧形牙槽骨吸收，遠中根處尤為明顯，近中根處牙周膜間隙增寬;相比于LPS+soft組，LPS組則吸收更為明顯，且牙根與牙槽骨表面顯得較為粗糙。

測量結果經統計學分析后發現：三組牙槽骨吸收高度比較差異具有統計學意義（P<0.001）。兩兩比較后得出：control組與LPS組牙槽骨吸收高度比較差異有統計學意義（P<0.0001），control組與LPS+soft組牙槽骨吸收高度比較差異有統計學意義（P<0.01），LPS組與LPS+soft組牙槽骨吸收高度比較差異有統計學意義（P<0.01）。見圖3。

2.2 組織病理學觀察結果：H&E染色結果顯示：與control組相比，LPS組和LPS+soft組均有一定程度的炎細胞浸潤，破骨細胞增殖，骨吸收陷窩形成，牙槽骨表面凹凸不平;LPS+soft組相比于LPS組炎性細胞數量減少，牙槽骨表面平整度較好。見圖4。

注：A.control組;B.LPS組;C.LPS+soft組。黑色箭頭指示破骨細胞及骨吸收陷窩;紅色箭頭指示炎細胞浸潤區域

2.3 Real-time PCR結果：Real-time PCR結果顯示：炎性相關因子IL-1β、IL-6與TNF-α的表達三組間差異均具有統計學意義（IL-1β：P=0.0014<0.01;IL-6：P=0.0076<0.01;TNF-α：P=0.0016<0.01，n=6～8）;且control組與LPS組間差異具有統計學意義（IL-1β：P=0.0046<0.01;IL-6：P=0.0068<0.01;TNF-α：P=0.0033<0.01，n=6～8）;LPS組和LPS+soft組間TNF-α水平比較差異具有統計學差異（P=0.0283<0.05，n=6～8）;而MCP-1三組間比較差異無統計學意義（P=0.2258>0.05，n=6～8）;所有因子在control組與LPS+soft組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖5。

注：A.IL-1β;B.IL-6;C.TNF-α;D.MCP-1。與control組比較，**P<0.01，n=6～8;LPS組與LPS+soft組比較，#P<0.05，n=6～8

2.4 IL-1β、TNF-α的ELISA檢驗結果：ELISA結果如圖6所示：IL-1β和TNF-α在LPS組中的濃度均顯著高于control組（IL-1β：P=0.0412<0.05;TNF-α：P=0.0364<0.05，n≥3）;而IL-1β和TNF-α在LPS+soft組中濃度與LPS組相比有降低趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。

注：A.IL-1β;B.TNF-α。與control組比較，*P<0.05，n≥3

3? 討論

牙周炎與牙列缺損是中老年人常見的口腔疾病[7]，且常常并存，對于修復醫生來說如何利用患有牙周炎的余留牙作為基牙進行修復是個難題。牙周病患牙若承擔過大的咬合力，則會加重牙周病，這個過程中牙周組織具體發生了怎樣的變化，機制是什么，是口腔研究的熱點問題。

成功建立一個牙周炎在體模型是本實驗的基礎。文獻表明，LPS是公認的牙周炎相關因素[8-9]，使用一定濃度的LPS在實驗動物牙周膜進行局部注射便能形成牙周炎[10-11]，且研究表明，45d后牙周炎表現仍然明顯存在[12]。另外，學者們還常將實驗鼠飲用水換成10%葡萄糖溶液作為輔助刺激因素誘導建模[13-14]，該方法操作簡單、無創。本次實驗中通過LPS的局部注射輔以高糖飲水來進行牙周炎模型的建立，以期更有效地獲取理想結果。眾所周知，異常的咬合接觸常常會迅速造成不適感，也是牙周病的促進因素之一，但并非是決定性的致病因素，Weston等[15]的Meta分析并沒有找到足夠證據支持或反對咬合調整有利于牙周治療的觀點。有綜述中提到食物的性狀會引起咀嚼肌活動的改變[16]，潘云潔[17]等實驗證明了食物硬度與咬合力存在相關性，也有研究表明過大機械應力作用下第4天起大鼠就會發生牙槽骨的改變，7d后趨化因子CCL2達到高表達水平，因此基于這些研究成果，設計改變食物硬度對牙周炎在體模型增加力學因素，并用7d作為加力時間[18-19]，以完成動物模型的建立。

本實驗中，建模后通過Micro-CT掃描后三維重建的結果直觀的看到，經過7d正常硬度飼料喂養的大鼠，對比軟飼料喂養的大鼠，其牙槽骨表面更加粗糙。經二維成像數據定量分析，與空白組對比無論軟飼料還是正常硬度飼料喂養組，牙槽骨的吸收量都有統計學意義。分析牙周炎患牙在受力較輕的狀態下，牙槽骨吸收速率會有所下降，成/破骨狀態會達到一個新的平衡，但想要通過較小的牙合力刺激，來達到促進成骨的目的，還需要進一步的研究證實。通過H&E染色，觀察到三組中破骨細胞增殖、炎細胞浸潤及骨吸收陷窩形成具有差異，也印證了三維重建的結果。

對取自實驗大鼠的牙齦組織樣本中的炎性相關標志基因做出mRNA表達水平的檢測。結果顯示相比于空白對照組而言，在正常硬度飼料喂養組中IL-1β、IL-6及TNF-α的表達水平均顯著升高。兩個實驗組之間對比，軟飼料喂養組低于正常硬度飼料喂養組表達水平的趨勢。推測停止LPS注射后，出現該現象的原因可能有以下3種：軟飼料喂養組炎癥存在但已停止進展，而正常硬度飼料喂養組繼續加重;軟飼料喂養組炎癥繼續加重但速率減慢，而正常硬度飼料喂養組則繼續急劇加重;軟飼料喂養組炎癥出現消退，而正常硬度飼料喂養組仍未出現改善。這樣看來，通過改變食物硬度減輕牙周炎患牙咀嚼負擔，對于控制炎癥而言，不失為一種有效措施。

此外，還嘗試通過采集齦溝液，使用ELISA檢驗對比齦溝液中IL-1β與TNF-α濃度的差異，來觀察牙周組織的炎性分泌水平的改變。結果顯示兩種蛋白在正常硬度飼料喂養組中的濃度均顯著高于空白對照組，符合結論。而軟飼料喂養組雖有低于正常硬度飼料喂養組的趨勢，但不具有統計學意義，其原因可能與齦溝液樣本量較少，檢測靈敏度等原因有關。

綜上所述，硬性食物會導致炎性牙周組織的炎癥反應程度出現差異;較軟食物相對正常食物而言有減輕牙周炎性狀態的作用。這提示在臨床修復工作中，不但應積極治療基牙的炎癥狀態、盡量減輕牙周炎患牙的咀嚼負荷，還應建議患者在日常飲食中食用軟質食物，以改善基牙的炎性狀態，延長余留牙與修復體的使用壽命。

本實驗雖得出了一些有意義的結果，但仍存在一些不足，如因為動物倫理審查的原因導致實驗動物數量不夠充足，為增加處理組動物數量，盡量減少實驗誤差而導致實驗設計中正常對照組動物數量較少，在后續實驗中將盡可能增加樣本量，同時優化實驗設計，進一步提高研究可信度。

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[收稿日期]2020-05-28

本文引用格式：張博倫，賈如，胡波，等.不同咀嚼負荷對牙周組織炎癥狀態影響的實驗研究[J].中國美容醫學，2020，29（8）：23-27.