間接法建立總膽紅素和直接膽紅素參考區間的探討

吳 群， 沈雋霏， 吳文浩， 王蓓麗， 潘柏申， 郭 瑋

（復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032）

臨床實驗室為了給臨床提供可靠的判斷標準需要建立一個準確、可靠的生物參考區間[1]。目前國際上認可的參考區間建立金標準為2010年由國際臨床化學和檢驗醫學聯合會（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）及美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）共同修訂的《臨床實驗室如何確定和建立生物參考區間；批準指南——第3版》（EP28-A3c導則），導則中提出通過建立排除標準，選取合適的參考樣本來獲得參考值（直接法）是建立參考區間的首選方法[2]。然而，直接法的建立需要消耗大量費用和時間，操作又較為繁瑣，不利于推廣和臨床運用，因此現今大部分臨床實驗室直接引用廠商提供的參考區間，未考慮人群、地域等流行病學差異，這可能會導致參考區間不適用，從而給臨床診療帶來困擾[3]。因此，通過一個更為簡便且科學的方法來獲得參考區間成為臨床實驗室關注的焦點。目前，有眾多學者提議利用實驗室既有數據來建立以數學統計模式為基礎的參考區間（間接法）[4-6]。為此，本研究利用復旦大學附屬中山醫院生物信息數據庫中儲存的膽紅素檢測數據及前期研究確立的間接法來建立膽紅素的參考區間，并與直接法進行比較，驗證運用間接法建立參考區間的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集復旦大學附屬中山醫院實驗室信息系統中儲存的2017年1—12月體檢中心體檢健康者的膽紅素檢測數據，項目包括總膽紅素（total bilirubin，TB）和直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）。剔除信息不全的數據，通過比對實驗室信息系統中儲存的患者卡號篩選同一來源數據并選取時間最早的檢測結果。

1.2 儀器和試劑

采用礬酸鹽法檢測TB和DBil，試劑和校準品均購自日本Wako公司，檢測儀器為Cobas c 702全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）。采用3水平常規生化多項目質控品（美國Bio-Rad公司，2017年批號分別為45721、45722、45723）及Westgard多規則（13s和22s）進行室內質量控制。

1.3 方法

采用間接法[7-8]建立TB和DBil的參考區間。

1.3.1 數據信息 健康體檢人群的TB和DBil檢測數據信息見表1。

表1 健康體檢人群TB和DBil檢測數據信息

1.3.2 數據正態性檢驗及轉換 采用偏度-峰度檢驗[9]對數據進行正態性分析。非正態分布數據通過BOX-COX變換[10]轉變為近似正態分布，并對變換后的數據使用偏度-峰度檢驗分析正態性。

1.3.3 離群值剔除 采用四分位間距法[11]剔除離群值。

1.3.4 數據分析 將收集的數據根據性別進行分組，采用非參數秩和檢驗分析是否存在性別差異，如有差異則分組建立參考區間。

1.3.5 參考區間的建立和驗證 對剔除離群值后的數據使用Hoffman法[4]計算5%或95%位點的數值，最后再轉化為最初的表達形式，得到最終的參考區間。計算各項目參考區間上、下限值與直接法建立的參考區間（我國行業標準）的相對偏差（兩者的參考下限之間及參考上限之間差異的百分比）[12]，并與參考變化值（reference change value，RCV）進行比較，RCV的計算公式為：RCV=21/2×Z×（CVa2×CVi2）1/2，式中CVa為分析變異系數，CVi為個體內膽紅素的生物學變異系數[13]，Z為差異的可能性概率值，取1.96（95%的可能性概率）[14]。相對偏差≤RCV認為二者之間無明顯差異，高于RCV認為二者存在差異。

1.4 統計學方法

采用Excel 2016軟件進行數據排序，計算RCV和參考區間的差異百分比。采用Minitab17軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 數據的正態性檢驗及轉換

偏度-峰度檢驗結果顯示，TB和DBil數據均呈非正態分布。采用BOX-COX對數據進行正態性轉換，轉換后各組數據均呈近似正態分布。見表2。

2.2 離群值剔除

使用四分位間距法剔除大于第75百分位數（P75）+1.5倍四分位間距（inter-quartile range，IQR）和小于第25百分位數（P25）-1.5倍IQR的數據。TB數據中，男性剔除784例，女性剔除578例；DBil數據中，男性剔除925例，女性675例。見表3。

表2 各組數據正態性檢驗和BOX-COX變換前、后結果

表3 離群值剔除前、后的數據對比

2.3 不同性別之間TB、DBil的差異

TB和DBil男、女性之間差異均有統計學意義（P=0.000），因此需按性別建立不同的參考區間。見表4。

表4 男性、女性TB、DBil檢測結果比較μmol/L，中位數（范圍）

2.4 參考區間的建立和驗證

采用Hoffmann法獲得男性、女性參考區間，TB男性、女性及DBil男性參考區間與直接法參考區間的相對偏差均低于RCV，提示建立的男性、女性TB參考區間及男性DBil參考區間與直接法參考區間無差異；DBil女性參考區間與直接法參考區間的相對偏差高于RCV，提示建立的女性DBil參考區間與直接法參考區間有差異。見表5。

表5 本研究建立的參考區間與直接法參考區間的比較

3 討論

隨著數字化和信息化時代的到來，“大數據”在醫學領域也開始發揮作用，數據本身并不能產生價值，但是如何分析和利用大數據來為醫學領域的工作作出貢獻才是關鍵。而利用間接法來建立臨床實驗室生物參考區間則是大數據帶給我們的禮物之一[15]。

眾所周知，運用直接法建立參考區間雖然是金標準，但可行性較低，難以推廣。因此大部分臨床實驗室直接沿用試劑廠商提供的參考區間，忽略了人群、地域等生物學差異，難以為臨床提供適宜且可靠的參考區間。因此，以既有數據為基礎，用數學統計方法來建立參考區間的間接法受到了廣泛關注。EP28-A3c導則中也指出了直接法的局限性，并且允許實驗室轉化、驗證或自行建立適合自己實驗室的參考區間[4]。復旦大學附屬中山醫院已通過醫院數據庫的數據驗證并建立了一些項目的參考區間，為后續的研究者提供了參考。

膽紅素在評估肝膽疾病及溶血性疾病方面具有重要意義，因此準確建立參考區間非常重要。目前，國內已有若干研究利用直接法建立了各地區的膽紅素參考區間[16-17]，但是尚未有文獻報道使用間接法驗證或建立膽紅素的參考區間。為此，本研究旨在利用前期研究中的數據使用間接法來進行膽紅素參考區間的建立和驗證。

本研究使用了2017年體檢者的膽紅素數據，采用間接法建立TB和DBil的參考區間。結果顯示，TB和DBil數據均呈非正態分布，使用BOX-COX法將數據轉換為近似正態分布，隨后采用四分位間距法剔除離群值。另外，由于TB和DBil男性、女性之間差異均有統計學意義（P=0.000），因此需按性別建立不同的參考區間。我國衛生行業標準WS/T 404.4—2018中TB的參考區間分為男性和女性2個組，而DBil未按性別分組，因此本研究中可能是由于樣本量不足等原因，導致得出男女需分組的結論。由于膽紅素為單側參考區間，因此本研究采用第95百分位數作為參考區間上限，計算自建的參考區間與我國行業標準參考區間的偏差，將偏差與RCV比較。TB男性、女性與直接法參考區間的相對偏差均低于RCV，提示建立的男性、女性TB參考區間與直接法參考區間無差異，進一步證明了利用間接法建立參考區間的可行性。DBil男性參考區間與直接法參考區間的相對偏差均低于RCV，而女性則略大于RCV，原因可能是：（1）DBil檢測結果較低，因此其變異系數（coefficient of variation，CV）相對較大，且檢測結果越低，CV越大，導致差異略大于RCV；（2）采集的數據并不能夠完全代替整個人群，始終存在人群和地域等生物學差異；（3）數據量不足。

采用間接法建立參考區間已經得到眾多學者的認可和驗證。本研究采用間接法建立了TB和DBil的參考區間，證明了采用四分位間距法聯合Hoffman法建立參考區間的可行性。但間接法尚無統一的導則和標準，無法確定間接法所用的統計方法是否準確可靠，并且采集的數據也并不能完全代表目標人群，數據統計方面也存在個體差異等。同時，由于各實驗室數據庫數據量不一，又無相關指南規定數據量的標準，因此可能會出現差異。目前，已有多篇文獻利用直接法建立了自己地區的膽紅素參考區間，也普遍認為各地區膽紅素差異較大，需要建立自己地區的參考區間[16-18]。盡管目前有著諸多限制，間接法仍可依靠其相對簡便、科學的優勢，為建立符合臨床實驗室要求的參考區間提供一條新的思路。

綜上所述，本研究采用間接法建立的TB男性、女性和DBil男性參考區間與直接法參考區間無差異，證明采用間接法建立參考區間的可行性。而DBil女性參考區間與直接法參考區間的偏差雖稍大于RCV，但可以通過采集更多數據量并選取與直接法參考區間建立人群相似的人群數據等方法來減小這種差異。