結直腸癌中lipocalin 2的表達及臨床病理特征分析

孟曉樂，李 慧，張書銘，王桂梅，唐華美

結直腸癌是全球最常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率在北美和歐洲位居第2位，在中國位居第5位，城市地區比農村高發，并且近年發病率迅速上升[1-2]。盡管手術切除和新輔助治療改善了部分結直腸癌患者的預后，但轉移和復發仍是其預后不良的主要原因[3]。目前結直腸癌的研究主要集中于探索調控其發生和進展的分子靶標。因此，迫切需要深入揭示結直腸癌的分子轉移過程，尋找更有效抑制其轉移和復發的診療靶點。脂質運載蛋白2(lipocalin 2, Lcn2)是lipocalin超家族的成員之一，也稱為中性粒細胞明膠酶相關的載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)，相對分子質量為2.5×104，參與運輸疏水小分子，如視黃醇和維生素D，并且調節免疫反應、細胞生長代謝、鐵轉運和前列腺素的合成[4-5]。多種腫瘤如乳腺癌[6-7]、肝細胞癌[8]、食管癌[9]、腎透明細胞癌[10]、子宮內膜癌[11]、結直腸癌[12-13]及神經內分泌腫瘤[14]等均已被發現參與腫瘤發生、進展和轉移，表明其可能是惡性腫瘤中潛在的生物學標志物或治療靶點，而Lcn2在腫瘤發生和轉移過程中的功能作用仍存在較大爭議。本文主要探討Lcn2在結直腸癌中的表達及與臨床病理特征關系，為臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018～2019年福建醫科大學附屬廈門弘愛醫院存檔的40例結直腸癌標本，所有患者均未行放、化療，臨床病理資料均完整。新鮮組織標本離體20 min內，快速收集并冷凍于-80 ℃冰箱，術后常規病理活檢標本進行切片染色。另收集距腫瘤>5 cm的正常腸黏膜組織作為對照。

1.2 主要試劑RNA 提取試劑：Total RNA Extractor (Trizol)、乙醇(Ethanol absolute)、異丙醇(Isopropanol)購自Sangon Biotech公司，三氯甲烷購自國藥集團。反轉錄試劑盒(Fast King RT Kit)、實時熒光定量PCR試劑盒(SuperReal PreMix Plus-SYBR Green)購自TIANGEN公司。Lcn2正向引物：3′-TC ACCTCCGTCCTGTTTAGG-5′，反向引物：3′-CGAAG TCAGCTCCTTGGTTC-5′；actin正向引物：3′-AAGGT GACAGCAGTCGGTT-5′，反向引物：3′-TGTGTGGA CTTGGGAGAGG-5′，由上海生工生物合成。兔抗人抗體Lcn2/NGAL(ab125075)、鼠抗人β-tubulin(ab6046)購自Abcom公司，山羊抗兔及抗鼠二抗均購自三箭生物公司。組織裂解液RIPA等購自索萊寶公司。Western blot試劑及BCA蛋白濃度定量試劑盒購自Thermo Scientific公司，顯色液購自Bio-Rad公司。免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鈉等，均購自福州邁新公司。石蠟組織標本用二甲苯、梯度乙醇等處理。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR 將冷凍于-80 ℃冰箱的新鮮組織經液氮冷凍研磨破碎后加入Trizol裂解液獲取總RNA，經反轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。qRT-PCR檢測：每組樣品3個重復，以actin作為內參，分別檢測癌與癌旁組織，取Ct均值，計算△Ct和△△Ct，最后求2-△△Ct值，即為癌組織的mRNA相對含量。qRT-PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，1.5%濃度的膠，130 V電泳30 min。

1.3.2Western blot法 將冷凍于-80 ℃冰箱的新鮮組織經液氮冷凍研磨破碎后經RIPA裂解，應用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。樣品煮沸后進行Western blot電泳。5%的牛奶室溫封閉2 h；一抗4 ℃搖床孵育過夜；二抗室溫搖床2 h；抗體洗滌液為TBST，每次10 min，合計3次。

1.3.3免疫組化 免疫組化染色采用SP法，標本5 μm厚連續切片，經二甲苯脫蠟；梯度乙醇至水；pH 6.0檸檬酸鈉抗原熱修復；過氧化物酶阻斷；血清封閉；一抗4 ℃過夜；生物素二抗孵育；DAB顯色；蘇木精復染。免疫組化結果經病理科3名診斷醫師評估。根據染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。根據陽性染色細胞百分比評分：陽性細胞數<10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分。兩項結果相乘：0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為()，≥9分為()；其中<5分為低表達，≥5分為高表達。

1.4 統計學分析運用Graph Pad 7.0、Image J進行作圖和數據處理，組間比較采用配對t檢驗，計數資料采用χ2檢驗及矯正χ2檢驗統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌中Lcn2的mRNA水平應用qRT-PCR法檢測Lcn2的mRNA相對含量，actin、Lcn2的cDNA片段長度分別為195、242 bp(圖1A)，內參actin基本一致，經相同擴增次數后結直腸癌組織Lcn2的條帶更亮，癌旁組織條帶較暗。統計分析40例配對樣品中Lcn2的相對表達量(2-△△Ct)，癌組織中Lcn2的mRNA水平較癌旁組織明顯升高，差異有統計學意義(P=0.006 5，圖1B)。

2.2 Western blot法檢測結直腸癌中Lcn2 蛋白水平總蛋白進行SDS-PAGE電泳，內參β-tubulin相對分子質量為5.5×104，Lcn2相對分子質量為2.5×104，Western blot法檢測結果顯示結直腸癌組織內Lcn2蛋白表達均明顯高于癌旁組織，且Lcn2/β-tubulin的蛋白相對表達量在結直腸癌組織中升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖1 qRT-PCR檢測Lcn2在配對結直腸癌組織中的mRNA水平：A.凝膠電泳：1～3.癌旁組織中Lcn2，4～6.結直腸癌組織中Lcn2，7～9.癌旁組織中actin，10～12.結直腸癌組織中actin，13.DNA ladder；B.配對結直腸癌組織中mRNA相對表達量

圖2 Western blot法檢測Lcn2在配對結直腸癌組織中的表達：A. Western blot分析，N.癌旁組織，T.結直腸癌組織；B.Western blot條帶灰度值比

2.3 結直腸癌中Lcn2的表達及與臨床病理特征的關系結直腸癌與癌旁組織進行免疫組化染色，高倍鏡視下見結直腸癌組織間質中浸潤的腺管上皮細胞胞質和胞膜呈棕黃色(圖3A)，癌旁組織上皮細胞胞質呈淺棕色或無著色(圖3B)。根據免疫組化染色強度與陽性率進行評分，統計分析Lcn2表達與臨床病理特征的關系，結果顯示：Lcn2蛋白在腫瘤直徑>5 cm(100%，P=0.014)、腫瘤分化程度低(92.31%，P=0.017)、T4分期(92%，P=0.042)及無淋巴結轉移(92.31%，P=0.025)的患者中陽性率顯著升高；與其他臨床病理特征均無相關性(P>0.05)。尤其是在腫瘤直徑>5 cm、分化程度較低、分期高及無淋巴結轉移者，更易出現Lcn2的表達上調(表1)。

表1 結直腸癌中Lcn2表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

AB

3 討論

結直腸癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，經手術切除和新輔助治療后患者預后有明顯改觀，但轉移瘤的出現仍然較常見，因此研究腫瘤轉移機制中新的標志物或靶標對患者預后具有重大的臨床意義。近年研究發現，多種細胞均可表達Lcn2，且可廣泛游離于細胞外液和體液中，炎癥、缺氧及胰島素水平變化等刺激可升高其單體、二聚體及復合物的合成和釋放；而影響腫瘤進展和轉移的關鍵問題在于：Lcn2啟動腫瘤細胞的增殖、遷移侵襲、免疫耐受、血管生成等生物學功能的方式是由內向外還是由外向內發揮作用。部分研究證實Lcn2通過聯合表達MMP-9來調節維持細胞高度的凝膠活性作用，促進上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[6,15]。本組免疫組化結果發現在無淋巴結轉移的病例中，Lcn2高表達的比例為92.31%，有淋巴結轉移僅為57.14%；且無遠處轉移者Lcn2高表達的比例達79.49%，有遠處轉移者僅1例，由于標本較少未發現差異有統計學意義。Kim等[12]發現Lcn2具有腫瘤抑制基因的作用，在結直腸癌細胞系中沉默Lcn2可誘導細胞增殖和高度糖酵解，瘤細胞增殖過程中能量需求旺盛伴隨有氧糖酵解效應(Warburg效應)并為其提供豐富的營養物質，Lcn2通過能量代謝的重編程負向調控結直腸癌細胞增殖并抑制EMT，與本組實驗結果一致。此外，Lcn2抑制腫瘤轉移還涉及部分信號通路轉導，Feng等[13]發現Lcn2抑制結直腸癌轉移是通過減弱NF-κB依賴形式的Snail激活和EMT。值得注意的是，Candido直接通過組織芯片分析原發灶和轉移灶內Lcn2的表達，發現轉移灶內Lcn2的表達水平明顯低于原發灶[16]。曹亞男等[17]報道非小細胞肺癌患者血清中發現Lcn2的表達在骨轉移組高于無遠處轉移組，且骨轉移灶內Lcn2表達也高于原發灶。Lcn2表達模式在原發部位和轉移部位出現明顯分歧，本組病例中發生遠處轉移者僅1例，其原發灶Lcn2高表達，無遠處轉移者中有31例原發灶也發現Lcn2高表達(79.49%)，側面反映出Lcn2在結直腸癌原發灶的高表達模式，對于有遠處轉移的病例還需進一步擴大樣本量和特定轉移灶分析。因此，Lcn2在腫瘤進展中的表達模式和功能作用仍然存在較大爭議和分歧，尤其是對于腫瘤轉移過程中的作用還需要深入研究探索。雖然目前在多種不同腫瘤類型均已表明Lcn2參與腫瘤的發生和進展，但是其轉移機制中的作用尚未明確，可能成為腫瘤轉移過程中的生物學標志物。

本組結果顯示，qRT-PCR和Western blot檢測均發現Lcn2在結直腸癌組織中的轉錄和翻譯水平升高，免疫組化結果證實Lcn2在腫瘤組織中高表達，提示Lcn2可能參與結直腸癌的發生和進展。進一步臨床病理特征分析發現，Lcn2的表達與腫瘤大小、分化程度、T分期、淋巴結轉移均密切相關。但還需要進一步研究其與結直腸癌遠處轉移之間的關聯及預后指標的特異性，深入探討其在轉移過程中的重要功能。

綜上所述，本實驗結果表明結直腸癌中Lcn2的mRNA和蛋白水平均顯著上調，并發現其與結直腸癌的臨床病理特征密切相關，提示Lcn2參與結直腸癌的發生和進展，探究其在腫瘤轉移過程中的功能仍需要深入分析。