還原型谷胱甘肽靶向氧化應激對肝癌干細胞的作用

高 蘭，龍世棋，陳博鑫，章 俊

氧化應激(oxidative stress, OS)是貫穿腫瘤發生、發展過程的獨立病因，表現為胞內異常增多的活性氧物質(reactive oxygen species, ROS)堆積；造成細胞的OS損傷、OS誘導的細胞增殖以及抗瘤治療的不敏感等[1]。腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSC)是腫瘤細胞的重要亞群，其決定腫瘤的發生、自我更新、異質性及可塑性[2]。研究發現OS與CSC的相互作用促進腫瘤的發生、發展并誘導治療耐受。前期研究發現抗氧化六配位攜氧蛋白Cytoglobin(CYGB)在人肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)組織中的表達顯著降低[3]，補充CYGB通過下調胞內OS水平降低HCC細胞的干細胞性[3]；提示靶向OS與CSC之間異常調控為治療腫瘤提供多個可能的有效新靶點。還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)是細胞內重要的內源性氧化還原穩態保護劑，抑制GSH的代謝能夠提高乳腺癌干細胞對放療的敏感性[4]。外源性補充L-GSH能夠保護檳榔堿所致肝損害[5]。目前，GSH被研究或運用于各種慢性炎癥、心血管疾病及惡性腫瘤等疾病的輔助治療，但與肝癌干細胞(liver cancer stem cells, LCSC)的相互關系還未見報道。本實驗著重探討外源性GSH對LCSC生長及亞群分布的影響，評估其在肝癌治療的研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料收集人HCC細胞系HepG2、Huh7、SK-Hep1以及人正常肝細胞系LO2，用于本課題的研究。

1.2 實驗分組

1.2.1內源性總谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(T-GSH/GSSG)含量檢測的實驗分組 該實驗分為3種HCC細胞組及正常肝細胞組，評價不同分組間內源性GSH含量的差異，每組實驗重復2～3次。

1.2.2外源性GSH對胞內ROS水平作用的實驗分組 3種HCC細胞分為對照組及GSH處理組，DCFH-DA活性熒光染料標記、熒光酶標儀檢測熒光強度、評估胞內ROS水平，該實驗重復2～3次。

1.2.3外源性GSH對HCC細胞活力作用的實驗分組 3種HCC細胞系分為對照組及GSH處理組，CCK-8實驗檢測細胞活力，該實驗重復2～3次。

1.2.4肝癌干細胞球(HCC sphere)形成實驗分組 將3種HCC細胞分為對照組及25、50、100 nmol/L的GSH處理組，流式分析CD133陽性LCSC在HCC細胞中的比例。干細胞培養基培養HCC sphere形成，并測量其大小和計數。每組實驗重復2～3次。

1.3 T-GSH/GSSG的定量檢測將2 000個HCC細胞及正常肝細胞接種至避光96孔板中過夜貼壁后，使用胞內T-GSH/GSSG測試盒(南京建成生物公司)測定內源性GSH含量。檢測原理：使用比色法檢測樣品中巰基的含量；無色的5,5-二硫二硝基苯甲酸(DTNB)能夠被巰基化合物轉化為具有黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸，其在412 nm處具有最大吸收峰，使用試劑盒中的標準試劑繪制比色值(412 nm Absorbance，X軸)與GSH濃度(Y軸)的標準曲線并計算轉換公式，根據公式計算樣本中實際GSH的濃度。

1.4 OS的誘導及胞內ROS含量的檢測將足量HCC細胞接種至96孔板中過夜貼壁，為了進一步提高腫瘤細胞內OS水平，使用含20 μmol/L的H2O2培養基預處理HCC細胞30 min，PBS洗滌2次后，置換分別含有100 nmol/L的GSH或不含GSH的培養基中培養48 h。使用10 μmol/L的DCFH-DA(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate)活性熒光試劑(Sigma Aldrich公司)孵育30 min后，熒光酶標儀檢測熒光強度、評估胞內ROS水平。DCFH-DA與胞內ROS反應后生成的熒光物質7′-二氯熒光素(7′-Dichlorofluorescein, DCF)。熒光酶標儀檢測DCF熒光強度，評估胞內ROS水平。

1.5 CCK-8實驗檢測HCC細胞活力將2 000～4 000個HCC細胞接種至96孔板中，分別加入100 μL含有50 nmol/L的GSH或不含GSH的培養基中培養48 h。加入10 μL的CCK-8試劑孵育2 h，使用酶標儀檢測每孔溶液450 nm處的吸光度值。通過CCK-8檢測細胞線粒體脫氫酶活性，間接反映細胞活力(活細胞數量)。

1.6 HCC sphere的培養按每孔20 000個HCC細胞接種至24孔的低黏附性培養板(Ultra-low adherent plates，購自美國康寧公司)中，使用含不同濃度GSH的CSC培養基(Mammo Cult Human Medium Kit，購自Stemcell Technologies公司)體外培養HCC細胞6～8天，觀察孔內HCC sphere的形成及生長，顯微鏡下觀察及測量細胞球并對直徑>60 μm細胞球計數。

1.7 HCC干細胞性的誘導及亞群比例檢測為進一步誘導HCC細胞的干細胞性，本實驗使用低血清培養基(2% FBS培養基)培養誘導CSC。CD133分子是LCSC膜表面的重要分子標記。將含100 nmol/L的GSH低血清培養基處理48 h后HCC細胞收集，使用偶聯熒光素藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)的CD133熒光抗體孵育30 min后，流式細胞儀檢測CD133陽性細胞的百分比；流式結果使用二維圖示，設M2 gate(%)為CD133陽性細胞百分比。

2 結果

2.1 HCC細胞中T-GSH/GSSG的含量肝臟是GSH合成的重要器官，其通過與GSSG的相互轉換，快速、高效的調節細胞內的氧化還原穩態。使用T-GSH/GSSG檢測試劑盒定量評估不同HCC細胞系及正常肝細胞中內源性GSH的含量。首先配置梯度濃度分別為0、5、10、20、50和100 μg/mL的GSH標準溶液，加入胞內GSH檢測試劑避光孵育30 min后，酶標儀檢測412 nm處標準溶液的吸光度值，繪制標準曲線并換算濃度計數公式(圖1A)。同時測量正常肝細胞LO2，3種HCC細胞HepG2、SK-Hep1和Huh7中內源性GSH的含量。結果顯示：T-GSH/GSSG在3種HCC細胞中的含量比正常肝細胞中的含量顯著增高(P<0.05，圖1B)，即HCC細胞中GSH合成及氧化增多，催化GSSG合成增加。因此，推測HCC細胞內異常增多的ROS上調了胞內氧化還原穩態的平衡點，提高腫瘤細胞的抗氧化防御能力，增強腫瘤細胞拮抗OS損傷得以存活的能力。

2.2 外源性補充GSH對HCC細胞內ROS水平及細胞活力的影響GSH廣泛分布于人體各組織器官，是安全、無毒的內源性寡肽物質。已廣泛運用于臨床對各種因素所致急性肝損傷的輔助治療。本實驗發現HCC細胞內T-GSH/GSSG的含量顯著升高，氧化還原平衡點上調。因此補充GSH恢復及提高胞內GSH的儲備，觀察其對胞內ROS水平及細胞活力的影響。本實驗使用20 μmol/L的H2O2預處理HCC細胞，誘導胞內高水平OS。然后外源性導入100 nmol/L的GSH，檢測胞內ROS含量的變化。實驗發現GSH處理組中HCC細胞內ROS水平與對照組相比顯著降低(P<0.05，圖2A)；提示外源性補充抗氧化劑GSH能夠減少胞內異常堆積的ROS、下調HCC細胞內異常升高的OS。本實驗檢測外源性補充GSH對HCC細胞活力的影響，將3種HCC細胞系分為對照組及GSH處理組(50 nmol/L)體外培養48 h，使用CCK-8試劑檢測細胞活力。實驗發現外源性導入GSH與對照組相比顯著抑制HCC細胞活力(P<0.01，圖2B)；提示抗氧化劑GSH可能抑制腫瘤細胞內異常ROS堆積誘導的細胞增殖。

圖1 正常肝細胞及HCC細胞內T-GSH/GSSG含量測定：A.繪制標準品GSH吸光度值(X軸)與標準濃度(Y軸)曲線并推算濃度計數公式；B.比較正常肝細胞(LO2)與不同HCC細胞(HepG2、Huh7和SK-Hep1)中內源性T-GSH/GSSG含量的差異，*P<0.05

圖2 GSH對HCC細胞內ROS水平及細胞活力的作用：A.補充100 nmol/L的GSH對不同HCC 細胞內ROS含量的影響；B.補充50 nmol/L的GSH對不同HCC細胞活力的影響，*P<0.05，**P<0.01

2.3 外源性GSH不同濃度對LCSC生長的影響體外培養的CSC在干細胞培養基中呈球形生長，將3種HCC細胞系接種到干細胞培養基中生長6～8天，觀察梯度濃度為0、25、50和100 nmol/L GSH對HCC sphere形成的影響。實驗發現，外源性補充不同濃度GSH均有效抑制了HCC sphere形成的體積及數量(圖3)。鏡下觀察加入GSH顯著抑制HCC sphere形成的大小，其中HepG2和SK-Hep1細胞系中GSH的100 nmol/L處理組與對照組及GSH的25 nmol/L及50 nmol/L組相比，進一步抑制了HCC sphere形成的大小(P<0.05，圖4A)。HCC sphere計數結果顯示，GSH顯著抑制HCC sphere形成的數量(P<0.05，圖4B)。值得注意的是，100 nmol/L的GSH處理HepG2及SK-Hep1細胞，HCC sphere形成的數量比25、50 nmol/L的GSH處理的數量增多，本實驗推測可能是由于100 nmol/L的GSH顯著干擾了HCC sphere形成，部分HCC sphere沒有很好的形成球形結構，松散或解體造成HCC sphere的數量增多。本實驗結果顯示一定濃度范圍內補充抗氧化劑GSH能夠抑制LCSC的生長。

2.4 外源性GSH對LCSC亞群分布的影響本實驗發現補充GSH顯著抑制HCC sphere的生長。進一步探討補充GSH對LCSC在HCC細胞中亞群分布的影響，首先使用低血清(2% FBS)培養HCC細胞，誘導腫瘤的干細胞性。使用CD133特異性熒光抗體標記100 nmol/L的GSH處理后的不同HCC細胞，采用流式細胞分析CD133+LCSC在總HCC細胞中的比例。實驗發現，與對照組相比，GSH處理后顯著減少CD133+LCSC在腫瘤細胞中的亞群比例(P<0.05，圖5)，提示外源性補充抗氧化劑GSH能夠降低CSC。

3 討論

GSH是細胞內重要的還原劑，其通過自身的合成、消耗及降解，與GSSG的相互轉換，快速、高效的調節并維持體內的氧化還原穩態。足量GSH儲備能夠拮抗ROS的異常堆積及細胞的OS損傷。研究證實GSH參與多種細胞增殖、分化及凋亡等生命活動的調控。GSH的缺乏或GSH/GSSG的比值下降導致細胞易于遭受OS損傷，促進腫瘤的發生、發展，而提高GSH水平能夠增強細胞的抗氧化能力并拮抗腫瘤細胞中異常升高的OS[6]。深入研究發現肝癌患者術前血清中GSH含量降低，且氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)水平比術后顯著升高，顯示機體總抗氧化能力當量(trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC)降低。切除的肝癌組織中總GSH含量升高，且催化GSSG生成的GSH過氧化物酶(GPx)活性比癌旁組織顯著提高[7]。GSH過氧化酶2(GPx2)在肝癌組織中高表達，且表達水平與肝癌患者的甲胎蛋白水平、臨床分期以及不良預后呈正相關[8]。進一步研究發現腫瘤細胞異常表達GPx，GSH還原酶(GSR)及硫氧還蛋白等氧化還原反應調控分子，提高腫瘤細胞的抗氧化防御能力，保護腫瘤拮抗不良微環境，促進腫瘤的發生、發展[9]。本實驗發現T-GSH/GSSG在HCC細胞中的含量比正常肝細胞顯著升高，提示HCC細胞中GSH合成增多，并與胞內多量的ROS反應，生成GSSG增多。總之，本實驗推測高水平OS啟動腫瘤細胞的異常代謝及功能、上調胞內氧化還原反應平衡點、腫瘤細胞自身抗氧化防御能力增強，能夠拮抗不良微環境得以存活，促進了腫瘤的演進。

圖3 補充不同濃度GSH組處理不同HCC sphere形成大小及數量

圖4 補充不同濃度GSH對不同HCC sphere大小(A)及形成數量(B)的影響：不同濃度GSH處理組與對照組比較，*P<0.05；補充100 nmol/L的GSH處理組與25 nmol/L的GSH處理組比較，#P<0.05；補充100 nmol/L的GSH處理組與50 nmol/L GSH處理組比較，**P<0.05

圖5 不同濃度GSH對CD133+ LCSC亞群比例的影響：A.100 nmol/L的GSH處理不同HCC細胞經流式細胞檢測CD133陽性細胞比例，M1為無熒光標記細胞的熒光本底面積，M2為熒光標記后扣除本底增加的熒光面積；B.100 nmol/L的GSH處理不同HCC細胞經流式細胞檢測CD133陽性細胞比例統計分析，與對照組比較，*P<0.05

GSH廣泛分布于人體各組織器官，是安全、無毒的內源性三肽活性物質。其表達調控除了受胞內GSH水平的負反饋調控外，更重要的是依賴多種微環境刺激因素如ROS堆積等激活GSH合成限速酶-谷氨酰半胱氨酸合酶的高表達調控。進一步研究發現腫瘤細胞自身高表達GSH并不能拮抗腫瘤的發生、發展。xCT基因通過調控半胱氨酸及谷氨酸的轉運參與調控GSH的合成，RAS基因異常激活RAF/MAPK信號促進xCT的表達，而敲除xCT表達抑制了由癌基因KRAS介導惡性轉化細胞在動物體內嫁接瘤的生長，提示腫瘤細胞中GSH的穩定表達，被癌基因RAS 介導的細胞惡性轉化和腫瘤發生所依賴[10]。OS能夠激活胞內MAPK(ERK1/2和p38)及PI3K/AKT信號通路促進細胞增殖及生長[11]。因此，本實驗提出外源性補充抗氧化劑GSH的貯備，下調腫瘤細胞中異常OS過度激活的細胞增殖信號，同時反饋抑制腫瘤細胞內源性GSH異常表達的治療策略。體外實驗發現外源性補充足量GSH顯著抑制多種肝癌細胞的生長。一定程度上支持了本實驗的設想，為使用外源性GSH靶向異常OS治療腫瘤提供理論依據。

CSC是腫瘤細胞的重要亞群，OS能夠誘導腫瘤細胞的干細胞性。CSC具有GSH依賴性抗氧化系統，加強了腫瘤細胞的OS防御能力并使之獲得相應的干細胞表型[12]。文獻報道幾種外源性抗氧化劑的補充通過拮抗OS與CSC的相互作用，降低腫瘤的干細胞性及CSC的亞群比例，拮抗了腫瘤的發生、發展[3,13-14]。因此，本實驗進一步分析GSH對CSC生長及分群的影響；結果發現濃度為25～100 nmol/L的GSH顯著抑制HCC sphere的生長。CD133分子是LCSC表面最廣泛分布的干細胞標記[15]，進一步研究發現，外源性補充GSH同時降低CD133+LCSC在HCC細胞中的亞群比例。

綜上所述，本實驗論證外源性補充足量GSH能夠靶向CSC并抑制HCC細胞的生長，為靶向腫瘤異常OS及與CSC的不良作用治療腫瘤提供新的有效靶點和策略。最近研究報道內源性GSH的清除協同產生ROS的治療提高了CSC對電離輻射治療的敏感性[16]。電離輻射又可誘導腫瘤的轉移、干細胞性的增強及癌基因的活化[17]；提示GSH在腫瘤發生、發展過程中的調控機制復雜且多變，需積累更多病例進一步分析。