三陰型乳腺癌中BRG1和BRM的表達及臨床意義

閆夢麗，任新瑜，吳煥文，龐鈞譯，陳龍云，沈松杰，梁智勇

三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)由于缺乏ER和PR表達及HER-2基因擴增，治療方案非常有限，是導致女性乳腺癌病死率高的原因之一[1]。近年研究表明BRG1和BRM在多種腫瘤中具有重要作用并可作為抗癌治療的靶點[2]。據文獻報道在TNBC細胞系中，BRG1或BRM可能扮演著癌基因的作用，且與化療藥物敏感性相關[3]；但其在TNBC石蠟標本中的表達與臨床病理特征的關系及預后作用尚不明確。因此，本文著重探討BRG1和BRM蛋白在TNBC中的表達及意義，有可能為TNBC尋找新的治療靶點提供更多的依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集2000～2011年北京協和醫院行手術切除確診為TNBC標本197例，所有患者均有完整的臨床資料包括發病年齡、腫瘤直徑、組織學分級、p53表達、基底樣標志物表達、淋巴結轉移及遠處轉移等；并調取染色切片重新審閱，診斷均由兩位經驗豐富的病理學專家重新確認。隨訪信息均來自電話訪談或患者就診病歷查詢，包括總生存期(overall survival, OS)和無進展生存期(progression free survival, PFS)、治療方式、有無復發或淋巴結轉移等。隨訪開始時間為確診日期，終止時間為2019年3月1日。OS以TNBC確診日期到末次隨訪日期或死亡日期計算，PFS以手術切除至乳腺癌首次疾病復發或死亡隨訪時間計算。本實驗經北京協和醫院倫理委員會批準。

1.2 組織芯片制備根據HE切片挑選代表性腫瘤區域對供體蠟塊進行標記。使用英國 Mitogen Mini Core全自動組織芯片儀進行操作，每例標本取3個不同位置的直徑為0.1 cm的復孔。

1.3 免疫組化采用免疫組化EnVision兩步法染色，實驗均設陰、陽性對照。分別檢測兔抗人BRG1多克隆抗體(Proteintech公司)和BRM單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)在TNBC組織中的表達。

1.4 判讀標準BRG1或BRM陽性染色僅限于細胞核，以間質細胞和淋巴細胞為陽性內對照。根據顯色強度和陽性細胞百分比兩項指標判斷陽性等級。BRG1或BRM顯色強度評分為0～3分：無著色為0分；黃色為1分；棕黃色為2分；棕色為3分。陽性細胞百分比按以下四類進行評分：0～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分。兩項評分相乘為總得分(IRS)。最終表達水平分為陰性(IRS：0分)、弱陽性(IRS：1～4分)、中等陽性(IRS：6～8分)、強陽性(IRS：9～12分)。將病例分為兩組進行分析，低表達組(陰性和弱陽性)或高表達組(中等陽性和強陽性)。根據EGFR、CK5/6或CK14的免疫組化結果判定TNBC是否為基底樣亞型。只要表達上述3種標志物的1種或以上為陽性，即定義為基底樣亞型。以上結果均由兩名有經驗的病理醫師判斷。

1.5 統計學分析使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。評估TNBC中BRG1、BRM表達與各臨床病理參數的關系采用χ2檢驗。分析BRG1、BRM表達對TNBC患者預后的影響用Kaplan-Meier分析和Log-rank檢驗。Cox單因素回歸模型分析用來納入變量，Cox多因素回歸模型分析用以調整協變量。雙側P值<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征197例TNBC患者均為女性。患者平均年齡為50.8歲，中位年齡為49歲 (范圍：24～90歲)。組織學亞型以浸潤性非特殊類型乳腺癌(即導管癌)為主(185/197, 93.9%)，其余為浸潤性小葉癌和混合性癌(非特殊+小葉癌)各4例(4/197, 2.0%)，浸潤性微乳頭狀癌2例(2/197, 1.0%)，化生性癌及混合性癌(非特殊+黏液癌)各1例(1/197, 0.5%)。144例(73.1%)患者的腫瘤最大徑≤3 cm，僅4.1%的病例腫瘤最大徑>5 cm。p53陽性率占48.2%。約70%的病例組織學分級為3級。81例患者有淋巴結轉移(淋巴結陽性數1～56個)。67例患者發生遠處轉移。54例患者在隨訪過程中死亡(表1)。

2.2 TNBC中BRG1、BRM的表達BRG1、BRM陽性染色為棕黃色顆粒，定位于細胞核，少數BRG1免疫反應性強的病例，細胞質染色較弱(圖1)。197例TNBC中，分別有18.3%(36/197)和10.7%(21/197)的病例評定為BRG1和BRM低表達(陰性和弱陽性)，81.7%(161/197)和89.3%(176/197)的病例評定為BRG1和BRM高表達(中等陽性和強陽性)。8例患者同時伴有BRG1和BRM蛋白低表達，且BRG1和BRM蛋白表達水平存在相關性(P= 0.013)，即兩者易發生同時表達降低(表2)。

2.3 BRG1、BRM表達與TNBC臨床病理特征的關系BRG1表達與遠處轉移和組織學類型有關 (P<0.05)。BRG1低表達組和高表達組遠處轉移陽性率分別為51.5%(17/33)和31.8%(50/157)，

表1 三陰型乳腺癌的臨床病理特征

ABCD

表2 三陰型乳腺癌中BRG1與BRM蛋白表達的相關性

BRG1低表達組遠處轉移陽性率約為高表達組的1.6倍，BRG1低表達的病例更有可能伴遠處轉移。TNBC中特殊類型乳腺癌和非特殊類型(浸潤性導管癌)BRG1低表達率分別為50.0%和16.2%，特殊類型乳腺癌相對于非特殊類型(浸潤性導管癌)來說更易出現BRG1低表達。BRG1蛋白表達水平與TNBC患者的發病年齡、腫瘤直徑、組織學分級、p53表達、基底樣亞型、TNM分期、淋巴結轉移無相關性。BRM蛋白表達水平與TNBC臨床病理特征均無相關性(表3)。

2.4 BRG1、BRM表達與TNBC預后的關系197例TNBC中， BRG1低表達組病死率為42.4%(14/33)，明顯高于BRG1高表達組[25%(40/160)]；BRM低表達組與高表達組病死率基本持平(28.6%vs27.9%)。Kaplan-Meier生存分析顯示，BRG1高表達與TNBC患者更好的預后相關，OS(P= 0.018)與PFS(P= 0.031)差異有統計學意義；而BRM蛋白表達水平對TNBC患者預后影響較小(圖2)。Cox單因素分析表明，BRG1低表達、分期、淋巴結轉移和遠處轉移與OS顯著相關(表4)。BRG1高表達與患者較好的預后相關(OS：HR=0.486，95%CI: 0.263～0.897,P= 0.021；PFS：HR= 0.572, 95%CI: 0.342～0.958,P=0.034)。Cox多因素分析納入BRG1表達、發病年齡、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移和基底樣亞型時，BRG1可作為OS的獨立預后保護性標志物(HR= 0.479, 95%CI: 0.247～0.930,P= 0.030)。遠處轉移是OS和PFS較差的獨立危險因素(P<0.001，表5)。

表3 三陰型乳腺癌中BRG1、BRM表達與臨床病理特征的相關性

3 討論

近年SWI/SNF復合體由于編碼亞基高突變頻率而備受關注，BRG1是SWI/SNF復合物最常發生突變的亞基之一。迄今為止，研究已證實BRG1在多種腫瘤中起抑癌作用，如高鈣血癥型卵巢小細胞癌[2]和非小細胞肺癌[4]。本組數據支持BRG1在TNBC中具有抑癌基因作用，與文獻報道結論一致。然而，也有一些研究支持BRG1具有致癌作用。李青等[5]發現在胃癌中BRG1高表達與不良預后參數相關。造成這種差異的主要原因是不同的腫瘤類型有各自獨特的信號通路及發生、發展機制。

表4 三陰型乳腺癌患者預后的Cox單因素生存分析

表5 三陰型乳腺癌患者預后的Cox多因素生存分析

圖2 三陰型乳腺癌患者Kaplan-Meier生存分析，Log-rank檢驗：A.BRG1高表達患者的總生存期(P=0.018)；B.BRG1高表達患者的無進展生存期 (P=0.031)； C.BRM高表達患者的總生存期(P= 0.916)；D.BRM高表達患者的無進展生存期(P=0.733)

目前，BRG1和BRM在TNBC中的作用尚不明確，相關研究也非常有限。本實驗是評估BRG1和BRM表達與TNBC臨床病理特征關系及對預后影響的首個大規模隊列研究。現階段僅有兩項研究專門對BRG1在乳腺癌組織中的表達進行分析，兩項研究結果均支持BRG1具有促癌作用[6-7]。本組實驗顯示在TNBC中BRG1低表達組患者更易發生遠處轉移，BRG1高表達組患者的生存狀態優于BRG1低表達組，這與上述文獻報道結果不一致，可能是由于腫瘤異質性引起。乳腺癌中不同的分子亞型其分子特征、信號通路及預后方面往往存在非常大的差異。以上兩項研究均缺乏對乳腺癌特定分子亞型的分析，且大部分為激素陽性乳腺癌。值得一提的是，Do等[6]研究隊列中包含30例TNBC，60%的TNBC病例被評定為BRG1低表達，且TNBC組BRG1低表達率明顯高于其它亞型，但該研究未作進一步分析。此外，有文獻報道BRG1在TNBC細胞系中具有促癌基因作用。然而最新研究表明，乳腺癌細胞系尤其是MDA-MB-231，該細胞系在上述研究中被廣泛當作TNBC代表細胞系，實際上與基底樣轉移性乳腺癌樣本的基因表達譜和轉錄組均有非常顯著的不同[8]。因此，以上研究結論的可靠性仍需進一步商榷。另外，本組還發現BRG1表達水平與BRM之間具有相關性，兩者易同時發生表達降低，與在卵巢癌[2]和肺癌[4]等腫瘤中發現的現象一致。

早期實驗表明BRG1純合突變在胚胎發育過程中會導致小鼠死亡，雜合突變會增加小鼠乳腺腫瘤的易感性[9]。機制上尚有證據支持，BRG1可以與RB基因協同作用，誘導人腫瘤細胞形成扁平樣、生長受阻的細胞而發揮抑癌活性[10]。此外，BRG1蛋白是p53驅動轉錄激活所必需的一個元素，干擾BRG1表達將顯著抑制p53介導的細胞生長抑制和凋亡[11]。BRG1也可直接與BRCA1相互作用，BRG1陰性突變或BRCA1 11號外顯子的致癌缺失性突變均會導致p53介導的轉錄激活功能的完全消除[12]。本組BRG1與p53表達的差異雖無統計學意義，但BRG1高表達與p53陽性率之間存在一定相關性(P= 0.079)。此外，在正常培養的人乳腺上皮(human mammary epithelial, HME)細胞中，需要BRG1、FANCD2和BRCA1三者共同作用維持HME細胞分化的穩定性，任何一方的缺失均將導致HME細胞發生自發的上皮細胞-間質轉化和異常分化[13]。眾所周知，BRCA1可以抑制惡性腫瘤的發生，在調節人類細胞的復制、修復遺傳物質引起DNA損傷和維持細胞的正常生長等發揮重要作用。攜帶BRCA1突變的家族往往有較高的乳腺癌發病率，而且大多數由BRCA1突變介導的乳腺癌是TNBC。TNBC也常伴有Tp53突變(84%)和RB1突變/缺失(20%)[14]。鑒于BRG1與上述RB/p53/BRCA1抑癌基因蛋白有緊密的協作關系，因此BRG1可能在TNBC中發揮類似于RB1、p53或BRCA1抑癌基因的作用。此外，BRG1基因所在位置與19p13.2相對應，19p13.2～13.3等位基因丟失是乳腺癌發病機制中的常見事件，該位置常涉及多個預防乳腺癌和其它癌癥的腫瘤抑癌基因[15]。這些證據均非常有力地指向BRG1應該在乳腺癌中具有抑癌基因的作用。然而，本實驗無法獲取配對的TNBC病例中BRCA1和RB1狀態的信息，未來尚需進一步的實驗分析其在匹配的臨床樣本中的相關性。本實驗還存在其它一些不足，例如個別病例臨床數據不完整；因蠟塊損耗和資金有限，不能對病例的全部乳腺癌組織進行檢測等。