卵巢癌中SMS1對細胞增殖、侵襲和遷移的影響

杭 月，林昌岫，黃成日

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，早期癥狀不典型，大部分患者就診時已處于晚期，其中卵巢癌增殖、侵襲和遷移是影響治療、預后的主要原因[1]。尋找抑制卵巢癌增殖、侵襲和遷移的靶點對于緩解疾病意義重大。神經鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthase, SMS)是神經鞘磷脂(sphingomyelin, SM)合成途徑的最后一個酶，在卵巢癌中上調SMS1可誘導T細胞分化后識別卵巢癌細胞表面抗原，促進卵巢癌細胞凋亡[2]，但尚未發現對卵巢癌細胞侵襲和遷移的影響。SMS活性改變與SM、甘油二酯(diacylglycerol, DAG)、卵磷脂(phosphatidylcholine, PC)、神經酰胺(ceramide, Cer)水平變化有關[3]，SMS活性改變是否因其影響卵巢癌細胞中SM、DAG、PC、Cer水平的變化，從而影響卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移。本實驗通過檢測低表達SMS1對卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響，旨在探討SMS1與卵巢癌發生、發展的相關性，為卵巢癌的早期診斷及靶向治療積累臨床數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 人卵巢癌細胞系HO8910及人正常卵巢上皮細胞系Hose，購自中國上海科學院細胞系。

1.1.2試劑 Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reation, qRT-PCR)試劑盒購自Takara公司；DMEM培養基、胎牛血清購自Invitrogen公司，胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)試劑購自SIGMA公司，Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自Invitrogen公司，PCR儀購自Bio-Rad公司。引物由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與轉染 細胞培養：卵巢癌細胞HO8910復蘇后常規培養于DMEM培養基內，(10%胎牛血清、5%CO2、37 ℃飽和濕度)，3～5天待接種細胞生長鋪滿整個培養瓶底面后，胰蛋白酶消化，傳代培養，用于后續實驗。細胞轉染：根據參考文獻[4]及siRNA技術要求，設計針對SMS1的siRNA，采用國際通用與所有基因均無同源性序列的non-target siRNA為陰性對照。將培養至對數期的細胞接種于6孔(5.0×104個/孔)板中，siRNA組為實驗組，siRNA-NC轉染組為陰性對照組(negative control, NC)，利用Lipofectamine 2000分別轉染SMS1-siRNA、siRNA-NC，無轉染組為空白對照組(blank control, BC)，轉染48 h后，采用qRT-PCR和Western blot法檢測細胞SMS1蛋白表達，檢測轉染效率，篩選穩定表達SMS1的細胞進一步培養。引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2MTT法檢測細胞增殖 收集轉染成功的細胞，接種于96孔板中(1×104個/孔)，重復5孔，每孔培養基總量為200 μL，培養箱內常規培養(5%CO237 ℃)，分別于0、12、24、36、48、60、72 h時，每孔內加入5 mg/mL MTT溶液(每孔為20 μL)繼續培養4 h后加入DMSO，利用自動酶標儀于570 nm處檢測各孔光吸收值(A值)，繪制細胞活力曲線。

1.2.3劃痕實驗檢測細胞遷移 收集轉染后培養至對數生長期的細胞在6孔板中鋪板(1×105個/孔)，培養過夜，觀察細胞生長情況，單層生長細胞鋪滿6孔板時，10 μL滅菌移液器頭在細胞上垂直劃痕，PBS洗去劃痕中細胞，加入空白培養基培養，分別在培養0、48 h后選取5個視野，測量細胞中間劃痕寬度。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞侵襲 收集轉染后培養至對數生長期的細胞，胰蛋白酶消化，離心后加入空白培養基，混勻。Transwell小室上層加入基質膠Matrigel，將細胞在Transwell小室上層鋪板(1×105個/孔)，下室預先加入500 μL含10%胎牛血清的培養基，將Transwell小室放入24孔板內，于細胞培養箱培養24 h后，倒出培養基，PBS沖洗，風干、4%多聚甲醛固定，加入0.14%結晶紫染色，倒置顯微鏡隨機選取5個不重疊視野進行計數并拍照。

1.2.5SMS酶活檢測 消化、收集轉染成功后細胞，胰蛋白酶消化后勻漿、離心后取上清液，根據參考文獻[5]，37 ℃ 5 h，氯仿/甲醇抽提，干燥后，利用薄層層析法檢測SMS1酶活。

1.2.6細胞內SM、PC、Cer水平測定 檢測細胞內SM、PC：消化、收集轉染成功后的細胞，萃取脂質，加入酶顯色劑，孵育45 min后，利用自動酶標儀于595 nm處檢測吸光度(配制不同濃度SM、PC，繪制標準曲線，根據標準曲線測得吸光度對應的SM、PC濃度)；Cer檢測：萃取脂質，加入含有DAG的緩沖液中孵育30 min，利用薄層層析法檢測Cer水平。

2 結果

2.1 正常卵巢細胞和卵巢癌細胞中SMS1 mRNA及蛋白的表達卵巢癌HO8910細胞中SMS1 mRMA及蛋白表達水平比正常卵巢細胞顯著升高(1.03±0.02vs2.74±0.01，t=187.321，P<0.05，圖1)。

圖1 正常卵巢細胞、卵巢癌細胞中SMS1 mRNA(A)及蛋白(B)的表達：與正常組相比，*P<0.05

2.2 siRNA-SMS1轉染后HO8910細胞中SMS1 mRMA及蛋白表達量轉染48 h后，siRNA(0.47±0.02)組細胞中SMS1 mRMA及蛋白相對表達量較NC組(1.07±0.02)與BC組(1.04±0.01)均顯著降低(t=51.962、62.440，P<0.05，圖2)。

圖2 siRNA-SMS1轉染后細胞中SMS1 mRMA(A)及蛋白(B)的表達：與陰性對照組相比，*P<0.05；與空白對照組相比，#P<0.05

2.3 siRNA-SMS1轉染后HO8910細胞內SMS1酶活變化轉染48 h后，siRNA組(0.76±0.03)細胞中SMS1酶與NC組(1.04±0.01)、BC組(1.02±0.02)相比，其顯著降低(t=21.689、17.664，P<0.05，圖3)。

圖3 siRNA-SMS1轉染后細胞內SMS1酶活變化：與陰性對照組相比，*P<0.05；與空白對照組相比，#P<0.05

2.4 siRNA-SMS1轉染后HO8910細胞增殖siRNA-SMS1轉染后siRNA組A570與BC、NC組相比，其顯著降低(P<0.05，圖4)。

圖4 siRNA-SMS1轉染后細胞增殖：與陰性對照組相比，*P<0.05；與空白對照組相比，#P<0.05

2.5 siRNA-SMS1轉染后HO8910細胞的遷移和侵襲能力轉染后，siRNA組遷移指數、侵襲細胞數與BC、NC組相比，其顯著降低(P<0.05，表2，圖5)。

2.6 siRNA-SMS1轉染后HO8910細胞中Cer、PC、SM水平轉染后，siRNA組HO8910細胞中SM水平與NC、BC組相比，其顯著降低(P<0.05)；siRNA組HO8910細胞中Cer水平與NC、BC組相比，其顯著升高(P<0.05)；siRNA組HO8910細胞中PC水平與NC、BC組比較，差異無統計學意義(P>0.05，表3)。

圖5 siRNA-SMS1轉染后HO8910細胞的遷移、侵襲

表2 siRNA-SMS1轉染后HO8910細胞的遷移和侵襲能力

3 討論

SMS有SMS1和SMS2兩種同工酶，其中SMS1定位于順面高爾基體，與SM的生物合成有關，SMS1活性對于保持腎乳頭收集管細胞中細胞與細胞黏附結構至關重要[6]；SMS1影響膜運輸，是細胞增殖和凋亡過程的重要酶[7]。研究發現小鼠胚胎成纖維細胞中，敲除SMS1可抑制胚胎成纖維細胞的增殖[8]；下調SMS1抑制癌細胞增殖從而改善神經膠質瘤患者預后[9]。SMS1水平可影響癌細胞的增殖、侵襲和遷移。本實驗結果顯示，HO8910腫瘤細胞中SMS1 mRNA及蛋白表達水平高于正常卵巢細胞，在卵巢中可能SMS1水平的升高影響細胞是否發生癌變，對于卵巢癌的檢測意義重大。轉染48 h后，siRNA-SMS1組卵巢癌細胞中SMS1酶活降低，驗證siRNA-SMS1轉染HO8910細胞成功。轉染siRNA-SMS1后，HO8910細胞增殖能力、遷移、侵襲能力均降低，提示沉默SMS1基因導致一系列信號傳導調節細胞增殖分化的作用而抑制，最終實現抑制卵巢癌HO8910細胞增殖，降低其遷移及侵襲能力，但是具體作用機制還有待于進一步驗證。

表3 siRNA-SMS1轉染后HO8910細胞中SM、PC、Cer水平

SMS1活性改變可能會影響細胞內Cer、PC、SM及DAG等水平變化，進一步影響細胞功能。可催化其底物Cer及PC，生成SM及DAG。Cer、DAG可能與細胞凋亡、老化有關。其中Cer作為體內重要的生物活性物質，可特異性連接細胞外信號轉導，參與多種生物學反應[10]。呂勇剛等[11]的研究結果證明，Cer可呈劑量依賴性地促進細胞凋亡，降低細胞存活率；可能作為抑癌脂質，參與細胞自噬調控，導致細胞死亡[12]；Cer可能通過PI3K/mTOR等信號途徑參與肝癌[13]、子宮內膜癌[14]等疾病的發生、發展。此外，Cer還可能與細胞遷移、粘連、分化、衰老有關，可能與細胞增殖、侵襲有關[15-16]。SM是組成細胞質、膜的主要磷脂之一，參與調節多種基質蛋白及受體的活動，與信號轉導、調控有關，可通過多個信號通路調節細胞凋亡[17-18]，參與腫瘤的發生、發展；水平變化可能與神經細胞增殖、遷移有關[19]。本實驗結果顯示，HO8910轉染siRNA-SMS1后，siRNA組HO8910細胞中SM水平顯著降低，Cer水平顯著升高，提示沉默SMS1表達使SMS1催化作用減弱，對Cer的作用減弱，對其消耗量減少，導致其在細胞內積累，進而抑制卵巢癌HO8910細胞增殖、侵襲與遷移；同時SM因Cer的催化作用減弱，生成SM的量降低，同樣抑制卵巢癌HO8910細胞增殖、侵襲與遷移。

綜上所述，SMS1基因沉默后卵巢癌HO8910細胞增殖活性降低，細胞遷移、侵襲能力下降，可能與SMS1基因沉默引起SM水平降低、Cer水平升高有關，本實驗初步觀察SMS1對卵巢癌表觀指標的影響，具體機制有待于進一步分析。