TGF-β對RAW264.7細胞增殖、凋亡的影響

陳筱雪，郭 超，孫 斌，鄭孟文，賈永娜，黎昌學

破骨細胞增殖和凋亡在骨吸收及重建過程中具有重要作用，是多種細胞因子及基因參與的調(diào)控機制。TGF-β是TGF細胞因子超家族的成員，具有調(diào)節(jié)細胞遷移、黏附及刺激細胞外基質(zhì)合成的功能，可促進多種細胞的增殖、分化及凋亡[1]，同時在骨重建、創(chuàng)傷修復和胚胎發(fā)育中起重要作用。因其高度的復雜性和多樣化[2-3]，有關(guān)TGF-β對破骨細胞的影響報道較少。線粒體Caspase作為已知的主要凋亡信號傳導通路，能通過水解各種細胞成分使細胞凋亡。RAW264.7為小鼠破骨前體細胞系，可誘導形成破骨細胞[4]。本文著重探討TGF-β對RAW264.7細胞增殖、凋亡的影響，并闡明TGF-β及其濃度對骨重建的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器小鼠破骨前體細胞RAW264.7(漢恒生物細胞庫)；DMEM 培養(yǎng)基(Hy Clone，美國)，小鼠重組sRANKL、M-CSF(Promo Cell，德國)；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(APPLYGEN，北京)；PCR擴增儀(ABI，美國)；引物由南京諾唯贊生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將破骨細胞前體細胞系RAW264.7在含有青鏈霉素混合液及10%胎牛血清的高葡萄糖-DMEM培養(yǎng)基中進行常規(guī)培養(yǎng)，傳至第三代行細胞接種鋪板。接種24 h，使用50 ng/mL RANKL和30 ng/mL M-CSF在細胞培養(yǎng)基中誘導RAW264.7細胞。

1.2.2CCK-8細胞增殖實驗 將每孔4×103個細胞接種至96孔板，24 h后按照TGF-β不同濃度分為對照組和3個不同濃度處理組。對照組：TGF-β濃度為0 ng /mL；處理組：TGF-β每組濃度分別為1、2、5 ng /mL。分組觀察，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔分別加入20 μL CCK-8；使用酶標儀讀取450 nm吸光度值。

1.2.3流式細胞儀檢測TGF-β對RAW264.7細胞凋亡的影響 根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果中細胞增殖情況得出具有統(tǒng)計學差異的TGF-β濃度為5 ng/mL，設置其為TGF-β組濃度，選用處于對數(shù)生長期RAW264.7細胞。設置2個組分別為：對照組、TGF-β組(僅加入TGF-β濃度為5 ng/mL)。24 h觀察細胞生長正常后加藥，細胞5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。另設空白組用于流式細胞儀調(diào)試，培養(yǎng)72 h進行流式細胞術(shù)檢測。

1.2.4RT-PCR檢測 將RAW264.7細胞分為2組分別為：對照組(僅在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng))、TGF-β組(加入TGF-β濃度為5 ng/mL)。培養(yǎng)72 h后提取總RNA。紫外分光光度儀檢測A260/A280比率以驗證RNA純度和濃度。合成cDNA，進行RT-PCR。取cDNA 1 μL，SYBR Green Master mix 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，補水至20 μL。反應條件為95 ℃ 5 min預熱，95 ℃時15 s變性，60 ℃時1 min退火延伸，合計40個循環(huán)。將樣品在4 ℃下保持30 min，并將每個樣本重復3次。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。所用引物詳見表1。

表1 RT-PCR 的引物序列

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測TGF-β對RAW264.7細胞增殖的影響實驗分別加入1、2、5 ng/mL的TGF-β時，RAW264.7細胞增殖數(shù)均低于對照組，處理72 h時TGF-β(5 ng/mL)處理組與其他濃度處理組和對照組差異有顯著性(P<0.05，圖1)。提示TGF-β可抑制RAW264.7細胞增殖，其抑制作用隨著濃度及時間的增長而加強，呈時間、劑量依賴性。

圖1 CCK-8檢測TGF-β對RAW264.7細胞增殖的影響：*P<0.05

2.2 TGF-β對RAW264.7細胞凋亡的影響處理72 h，使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，TGF-β(5 ng/mL)處理組與對照組相比細胞總凋亡率升高(圖2)。經(jīng)統(tǒng)計學檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過TGF-β處理細胞72 h后，TGF-β(5 ng/mL)處理組與對照組相比，總凋亡率增加，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

2.3 RT-PCR檢測線粒體凋亡通道Caspase-3、Caspase-8的mRNA表達對照組用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)，根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果顯示，TGF-β(5 ng/mL)處理組加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，對RAW264.7細胞干預72 h，與對照組相比，TGF-β(5 ng/mL)處理組Caspase-3、Caspase-8的mRNA表達水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。

3 討論

骨組織缺損修復機制是目前關(guān)注的重點，除骨創(chuàng)傷修復外，其還與骨質(zhì)疏松甚至骨腫瘤相關(guān)[5]，且與牙槽骨吸收等口腔常見疾病有直接關(guān)系[6]。骨改建是一個連續(xù)的動態(tài)過程，主要通過成骨細胞與破骨細胞間相互作用共同調(diào)控新骨形成達到骨重建。其中，破骨細胞來自骨髓單核/巨噬細胞系，負責吸收骨組織中的骨質(zhì)，是影響骨折愈合的關(guān)鍵細胞之一[7]。近年，骨折愈合過程中TGF-β調(diào)節(jié)的研究成為焦點。作為功能相似、結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽生長因子和趨化因子，TGF-β影響骨生長、形態(tài)誘導和修復，具有重要研究價值。多種研究表明，TGF-β對骨組織的影響是雙向的。長期以來TGF-β被認為是一種骨吸收抑制劑，高濃度的TGF-β可以增強骨保護素(osteoprotegerin, OPG)和RANK的競爭性結(jié)合，從而抑制RANK與其配體的結(jié)合，導致破骨細胞的分化和成熟受到抑制。最近研究表明，在缺乏基質(zhì)細胞的體外環(huán)境中，TGF-β可以誘導破骨前體細胞中NF-κB和RANK的表達，促進破骨細胞的形成[8-9]。因此，其對破骨細胞增殖和凋亡的影響一直存在爭議。小鼠單核巨噬細胞RAW264.7是公認的破骨前體細胞，體外可以誘導形成破骨細胞[10]。目前文獻報道TGF-β對RAW264.7細胞增殖、凋亡及相關(guān)基因表達的影響較小，且本課題組前期報道由于巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)與RANK在RAW264.7細胞系中可以同時表達，由此激活RANKL從而使RAW264.7細胞誘導分化為破骨細胞[11]。故在此基礎上通過誘導RAW264.7細胞建立破骨細胞模型進行相關(guān)分析。

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況:A.對照組；B.TGF-β組

圖3 TGF-β對RAW264.7細胞凋亡的影響：與對照組相比，*P<0.05

圖4 線粒體凋亡通道Caspase-3(A)、Caspase-8(B)mRNA表達差異：與對照組相比，*P<0.05

本組CCK-8細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，處于24、48和72 h的RAW264.7細胞增殖數(shù)低于對照組，增殖受到抑制，且72 h時TGF-β(5 ng/mL)處理組與其他濃度處理組及對照組差異有顯著性。這些結(jié)果表明TGF-β可抑制RAW264.7細胞增殖，且其抑制作用呈時間、劑量依賴性。根據(jù)前期CCK-8實驗采用流式細胞術(shù)檢測5 ng/mL的TGF-β處理72 h后RAW264.7細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示細胞凋亡率與對照組差異有顯著性。提示TGF-β可以抑制RAW264.7細胞的增殖并促進其凋亡，從而可以減少破骨細胞數(shù)量達到減少或終止骨吸收的目的。其結(jié)果可能與TGF-β誘導的劑量、時間以及靶細胞內(nèi)有信號傳導途徑的激活狀態(tài)有關(guān)。Quinn等[12]認為骨吸收中TGF-β刺激成骨細胞下調(diào)RANKL表達，增加OPG表達。RANKL/RANK復合物減少，導致破骨細胞的增殖和分化減少。此外有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β能夠特異性激活SMAD信號傳導途徑，并且調(diào)控細胞的凋亡，使細胞增殖受到抑制。TGF-β還可促進細胞內(nèi)β-catenin的磷酸化降解，干擾β-catenin向細胞核移位進而阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制細胞增殖并誘導凋亡[13]，這與本組流式細胞學檢測結(jié)果一致。

除上述傳導途徑外，Caspase線粒體凋亡通路也是常見的經(jīng)典凋亡通路[14]。Caspase-8為凋亡啟動因子，在其它蛋白輔助下發(fā)生自我活化，并激活下游的凋亡執(zhí)行因子Caspase-3等導致細胞凋亡。通過RT-PCR技術(shù)檢測在5 ng/mL的TGF-β作用下RAW264.7細胞線粒體凋亡通道相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-8的表達，可以在分子水平檢測細胞凋亡調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TGF-β誘導組中，Caspase-3、Caspase-8表達水平顯著升高，表明RAW264.7細胞凋亡能力增強，與Quinn等[12]報道一致，TGF-β能增加RAW264.7細胞相關(guān)凋亡基因的表達，減少破骨細胞數(shù)量，抑制骨組織吸收。

綜上所述，本組分析不同濃度及時間下TGF-β對破骨前體細胞RAW264.7增殖和凋亡的作用，證實TGF-β作用于RAW264.7細胞可使其增殖減緩，并通過激活線粒體凋亡通道Caspase-3、Caspase-8信號通路，促進了細胞凋亡，減緩甚至終止骨吸收的進程，改善骨吸收疾病的預后。后期還需深入分析骨吸收相關(guān)信號通路如Wnt等，為藥物靶向治療骨吸收類疾病提供參考。