喉鱗狀細胞癌中BRAP和VEGF-C的表達及其與淋巴管生成的關系

殷文娟，張 玲，劉青華，白 瑋，王志華，李雅俊，李靈敏

淋巴道轉移是喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)主要的轉移方式，對腫瘤預后復發有重要影響[1-2]。在轉移過程中，淋巴管生成伴微淋巴管密度(micro-lymphatic vessel density, MLVD)增加，為腫瘤細胞進入淋巴管提供了更多可能。血管內皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)是VEGF家族最重要的因子之一，被認為是能誘導腫瘤淋巴管新生及促進腫瘤淋巴結轉移的重要因素[3-4]。

近期研究發現高表達BRCA1相關蛋白(BRCA1-associated protein, BRAP)與LSCC淋巴結轉移有關[5]，但其具體作用機制尚不明確。本文檢測84例LSCC組織中BRAP和VEGF-C蛋白表達，探討兩種蛋白在LSCC淋巴結轉移中的作用關系及對MLVD的影響，為進一步闡明LSCC的轉移機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2011年1月～2013年12月山西省腫瘤醫院LSCC患者手術切除的石蠟標本84例。患者術前均未行放、化療，其中男性81例，女性3例，年齡38～79歲。有淋巴結轉移者20例，無淋巴結轉移者64例。另收集距癌組織邊緣0.5 cm以上的癌旁組織標本15例作為對照組。所有組織標本由山西省腫瘤醫院病理科醫師確診，患者均有完整的臨床資料。

1.2 試劑BRAP、VEGF-C兔抗人多克隆抗體購自Proteintech公司；鼠抗人D2-40單克隆抗體(工作液)購自Zsbio公司；免疫組化PV 6000試劑盒購自Zsbio公司。

1.3 免疫組化采用免疫組化PV 6000法染色，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。BRAP、VEGF-C兔抗人多克隆抗體工作濃度分別為1 ∶400和1 ∶200，同時用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判斷免疫組化染色結果由兩位病理科醫師采用半定量分析法判定。BRAP、VEGF-C蛋白均主要表達于細胞質，呈棕黃色顆粒。參考Liu等[6]方法，鏡下隨機選取5個400倍視野進行陽性細胞著色程度評分和陽性細胞百分比評分。(1)按陽性細胞著色計分：細胞無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細胞百分比計分：≤25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。兩項得分結果相加為蛋白的表達水平：0～3分為低表達，4～6分為高表達。

1.5 MLVD計數D2-40表達于微淋巴管內皮細胞的胞質，呈棕黃色。微淋巴管計數參考Zheng等[7]方法，先在100倍鏡下尋找微淋巴管最密集的2個區域即“熱點”，然后200倍鏡下在每個熱點區域隨機選取5個視野進行微淋巴管計數(不包括管腔直徑超過8個紅細胞或管壁存在平滑肌的淋巴管)。結果采用2個熱點區域合計10個視野內微淋巴管數目的平均值作為MLVD。

2 結果

2.1 LSCC及癌旁組織中BRAP和VEGF-C的表達免疫組化PV 6000法檢測84例LSCC及15例癌旁組織中BRAP、VEGF-C的表達，兩種蛋白均位于細胞質中，呈淺黃至棕色(圖1、2)。LSCC組織中BRAP、VEGF-C的高表達率分別為65.5%、53.6%，明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2 LSCC組織中BRAP、VEGF-C表達與淋巴結轉移的關系有淋巴結轉移組中BRAP、VEGF-C表達高于無淋巴結轉移組，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 喉鱗狀細胞癌組織中BRAP、VEGF-C表達與淋巴結轉移的關系

2.3 BRAP與VEGF-C表達的相關性84例LSCC組織中，BRAP和VEGF-C同時高表達者37例，高表達率為44.0%，同時低表達者21例，低表達率為25.0%。LSCC組織中BRAP與VEGF-C的表達呈正相關(χ2=12.024，P<0.01，C=0.354，表3)。

表3 BRAP與VEGF-C表達的相關性

2.4 淋巴結轉移與MLVD值的關系D2-40陽性定位于淋巴管內皮細胞的胞質，呈棕黃色(圖3)。在LSCC組織中，D2-40位于癌周。LSCC組織和癌旁組織MLVD值分別為16.39±4.55、7.27±2.25，差異有統計學意義(t=11.927，P<0.01)；淋巴結轉移組的MLVD值高于無淋巴結轉移組，差異有統計學意義(t=9.387，P<0.01，表4)。

2.5 BRAP、VEGF-C表達與MLVD的關系比較BRAP、VEGF-C蛋白不同表達組的MLVD值，結果顯示高表達BRAP、VEGF-C組MLVD值分別高于低表達組(P<0.01，表5)。

①A①B②A②B③圖1 喉鱗狀細胞癌及癌旁組織中BRAP的表達,PV 6000法:A.癌旁組織;B.LSCC組織圖2 喉鱗狀細胞癌及癌旁組織中VEGF-C的表達,PV 6000法:A.癌旁組織;B.LSCC組織圖3 喉鱗狀細胞癌組織中D2-40的表達,PV 6000法

表4 淋巴結轉移與MLVD的關系

表5 BRAP、VEGF-C表達與MLVD的關系

表1 喉鱗狀細胞癌及癌旁組織中BRAP、VEGF-C的表達

3 討論

LSCC是耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤，其主要發生淋巴結轉移。淋巴結是否轉移直接影響LSCC的治療方式、局部復發和預后[8]。因此，分析LSCC淋巴轉移的相關機制對LSCC的早期診斷、及時治療具有非常重要的意義。

BRAP又稱BRCA1相關蛋白，能夠識別BRCA1的信號肽。BRAP調控細胞的分化、生長、侵襲、遷移[9-10]。既往研究顯示BRAP基因多態性和結直腸癌的發病風險相關[11]。Zhao等[10]研究顯示BRAP是食管癌細胞侵襲遷移相關基因，并促進裸鼠轉移瘤的形成。我們最近發現BRAP在LSCC組織中高表達，且其表達與LSCC的淋巴結轉移密切相關[5]。

VEGF-C是VEGF家族成員，被認為是重要的淋巴管內皮生長刺激因子，其在多種惡性腫瘤中呈高表達[4]。VEGF-C與淋巴管內皮細胞表面受體VEGFR-3特異性結合后，刺激靶細胞增殖，從而誘導淋巴管的增生及MLVD增高，促進腫瘤淋巴結轉移[3]。已有研究證實在多種惡性腫瘤包括喉癌中，VEGF-C高表達促進MLVD增高，與腫瘤淋巴結轉移密切相關[7,12]。

本實驗結果顯示，BRAP、VEGF-C在LSCC組織中均呈高表達，且與淋巴結轉移顯著相關，提示兩者在LSCC淋巴結轉移過程中有促進作用。BRAP、VEGF-C高表達時MLVD值均顯著增高，提示BRAP、VEGF-C可能通過誘導淋巴管生成促進LSCC淋巴結轉移。

統計學分析顯示，BRAP與VEGF-C在LSCC中的表達呈正相關，提示兩者在LSCC的淋巴管生成及轉移中呈協同作用。Ozaki等[13]對冠脈內皮細胞的研究證實敲降BRAP的表達可以抑制NF-κB信號通路，而VEGF-C是NF-κB調控腫瘤侵襲轉移重要的下游通路；Zhao等[10]對食管癌的研究中，從免疫組化染色和細胞水平的實驗證實了BRAP和VEGF-C的表達呈顯著正相關，且BRAP對VEGF-C的調控是通過NF-κB通路實現的。以上研究與本組實驗結果中BRAP與VEGF-C呈顯著正相關結果一致，提示LSCC中高表達的BRAP有可能通過NF-κB途徑刺激VEGF-C的表達。目前，關于BRAP在LSCC淋巴結轉移過程中的作用機制及其與VEGF-C的關系尚待進一步分析。

綜上所述，BRAP、VEGF-C在LSCC中高表達，均與腫瘤的淋巴結轉移密切相關。抑制BRAP的表達，可能通過下調VEGF-C而減少淋巴管生成及淋巴道轉移的概率。