胸腺上皮性腫瘤中PD-L1與MMR的表達及臨床意義

張玉萍，候 倩，蔡曉珊，徐國棟，馬 昊，王 慧，張云香

胸腺上皮性腫瘤(thymic epithelial tumors, TET)是起源于胸腺上皮細胞或向胸腺上皮分化的腫瘤，其生物學特征是從具有惡性潛能到惡性的過程[1]。TET以手術為主輔助放、化療等多學科治療，但部分患者預后較差。目前TET分子生物學特征尚不清楚，分析TET的發病機制、分子靶標迫在眉睫。PD-1/PD-L1單抗是當前備受矚目的新一代免疫療法，經美國食品藥品監督管理局(FDA)批準，現已有多種PD-1/PD-L1單抗用于惡性腫瘤的臨床治療，并取得較好的療效，且Le等[2]發現錯配修復(mismatch repair, MMR)狀態可用于預測PD-1/PD-L1抑制劑的療效。近年研究顯示PD-L1表達與TET惡性程度及預后相關[3-4]，但關于MMR在TET報道較少。本文通過檢測TET中PD-L1和MMR蛋白的表達，旨在探討兩者表達與TET臨床病理特征之間的關系，以期對TET免疫治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016～2019年山東省濰坊市人民醫院和山東省濰坊市第二人民醫院病理科手術切除，經病理檢查確診為TET標本60例。根據WHO(2015)胸腺腫瘤組織學分類標準，由兩名病理醫師復閱切片明確腫瘤的組織學分型，對有足夠腫瘤細胞組織進行免疫組化檢測；另收集相關臨床病理資料。

1.2 方法所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，3 μm厚切片。免疫組化采用EnVision兩步法染色。MMR用已知陽性組織做陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照；PD-L1采用試劑盒陰陽性切片做對照。MLH1試劑盒購自福州邁新公司，MSH2、MSH6、PMS2試劑盒購自北京中杉金橋公司，PD-L1試劑盒購自Dako公司。

1.3 結果判讀MMR定位于細胞核，在陽性對照及內對照(上皮細胞、正常腸上皮特別是腺體基底部細胞、間皮細胞、淋巴細胞等)陽性前提下，腫瘤細胞核著色即判讀為陽性[5]。至少一種蛋白表達缺失提示為MMR表達缺失(deficient mismatch repair, dMMR)，4種錯配修復蛋白均表達時，判為錯配修復功能完整(proficient mismatch repair, pMMR)；通常MLH1聯合PMS2表達缺失，而MSH2聯合MSH6表達缺失[6]。PD-L1定位于細胞膜，根據細胞著色強度判斷：0～2分為陰性，3～5分為陽性[7-9]。

1.4 統計學分析采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。PD-L1和MMR蛋白表達及其與臨床病理特征各組間比較采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法檢驗，變量間的相關性應用Spearman相關性分析，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特點60例TET中胸腺瘤46例、胸腺癌14例，其中A型胸腺瘤12例，AB型胸腺瘤10例，B1型胸腺瘤10例，B2型胸腺瘤9例，B3型胸腺瘤5例，胸腺癌14例；男性27例，女性33例；患者年齡25～80歲，中位年齡57歲，好發于50歲以后；腫瘤直徑2.0～22 cm；17例伴重癥肌無力；17例伴淋巴結或其他器官轉移，其中胸腺癌有11例發生轉移。

2.2 TET中PD-L1表達與臨床病理特征的關系60例TET中35例(58.33%)PD-L1陽性，其中A型胸腺瘤3例，AB型胸腺瘤5例，B1型胸腺瘤6例，B2型胸腺瘤6例，B3型胸腺瘤4例，胸腺癌11例；PD-L1在B3型胸腺瘤和胸腺癌的表達顯著高于A、AB、B1和B2型胸腺瘤，差異有統計學意義(P=0.03)；PD-L1表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、是否伴重癥肌無力，差異均無統計學意義(P>0.05，表1，圖1)。

表1 胸腺上皮性腫瘤中PD-L1表達與臨床病理特征的關系

2.3 TET中MMR表達與臨床病理特征的關系60例TET中有11例(18.33%)發生MMR蛋白表達缺失，以MLH1和PMS2聯合缺失為主(11.67%，7/60)。MSH2和MSH6在所有病例中均呈陽性。MMR蛋白缺失主要發生在A型胸腺瘤，明顯高于AB、B1、B2、B3型胸腺瘤和胸腺癌，差異有統計學意義(P=0.015)；MMR蛋白缺失與患者性別、年齡、腫瘤大小、有無轉移、是否伴重癥肌無力，差異均無統計學意義(P>0.05，表2，圖2)。

2.4 PD-L1與MMR表達的相關性本組結果顯示：PD-L1表達與MMR蛋白缺失之間無明顯相關性(P>0.05)。

3 結論

TET臨床罕見，探索有價值的分子標志物對其發病機制、治療、預后均具有重要的臨床意義[10]。腫瘤的免疫逃逸機制在腫瘤的發生、發展中有重大作用。目前，PD-1/PD-L1通路被認為是最重要的腫瘤免疫抑制通路。PD-L1與PD-1結合，通過傳遞負性調控信號，抑制T細胞增殖，調節細胞因子的表達和分泌，使腫瘤細胞逃逸機體的免疫監控和殺傷促進腫瘤進展，因此通過抑制PD-1/PD-L1通路可達到治療腫瘤的目的[11-12]。研究表明PD-L1和MMR基因是免疫靶向藥物療效預測的重要標志物[2]，本組PD-L1在TET中的陽性率為58.33%，回顧文獻[3,13-19]發現PD-L1蛋白在胸腺瘤中陽性率為18%～92%，可能與使用抗體克隆號不同、判讀標準不同、判讀主觀性及表達異質性等相關。既往研究發現PD-L1在胸腺癌和惡性程度高的胸腺瘤中高表達，且PD-L1高表達可作為腫瘤復發和預后差的標志物[3,7，14]。本組中PD-L1在B3型胸腺瘤和胸腺癌中的表達明顯高于其他類型胸腺瘤，表明PD-L1高表達與TET的惡性程度高相關。進一步分析發現，PD-L1表達與患者性別、年齡、腫瘤大小等臨床特征無明顯相關性，與Katsuya等[13]研究一致。

①A①B①C①D②A②B②C②D

表2 胸腺上皮性腫瘤中MMR表達與臨床病理特征的關系

MMR主要功能是糾正DNA復制過程中的錯誤，但在DNA甲基化或基因突變導致MMR功能異常或缺失的情況下會使微衛星重復序列核酸數量增多或減少，從而導致腫瘤的發生[20]。本組60例TET中有11例發生MMR蛋白缺失，以MLH1和PMS2聯合缺失為主，與以往研究結果一致[6]。MMR蛋白缺失在A型胸腺瘤中明顯高于其他類型胸腺瘤和胸腺癌，可能與A型胸腺瘤的發病機制有關，有待于進一步驗證；與患者性別、年齡、腫瘤大小、有無轉移、是否伴重癥肌無力無關。進一步對PD-L1和MMR蛋白表達分析發現，PD-L1表達與MMR蛋白缺失之間無相關性，分析原因有以下兩點：(1)本組中PD-L1表達與MMR蛋白缺失無相關性，可能與實驗樣本量小、樣本區域局限性有關；(2)文獻報道32種不同腫瘤類型的合計12 019例患者中，dMMR患者比例>5%的腫瘤僅占37.5%(12/32)[21]，dMMR的發生頻率較低，因此僅應用dMMR狀態篩選獲益的患者，可能會忽略部分對PD-1/PD-L1 單抗治療敏感的患者，應綜合考慮。

綜上所述，PD-L1高表達于B3型胸腺瘤和胸腺癌中，與TET惡性程度高相關，為臨床采用以PD-1/PD-L1為免疫靶點治療TET提供可能。我們還需收集更多樣本，深入探討PD-L1表達與MMR蛋白缺失在TET中的作用機制，為TET免疫治療提供更有價值的理論依據。