5種固定液對淋巴結冷凍切片HE及免疫組化染色效果的影響

王 鴻，周 晟，代 鵬

淋巴結組織纖維成分少，淋巴細胞豐富，往往還附有較多的脂肪組織，在制片過程中容易出現裂紋、細胞核皺縮、染色模糊甚至是脫片等，如需改善應嚴格控制冷凍的溫度和時間，挑選滲透力強、固定作用強的固定液。本文通過對固定液配方的探索，著重與病理醫師交流制片的方法與經驗，以提高淋巴結組織冷凍切片優良率。

1 材料與方法

1.1 材料選取2019年1～3月我院手術室送檢淋巴結組織標本30例，其中乳腺前哨淋巴結12例，中央組淋巴結14例，其它淋巴結4例。所有組織均符合快速病理標本送檢要求。

1.2 試劑與器材德國Leica-CM1950恒溫冷凍切片機；進口OCT膠水；徠卡DB-80刀片；組織防脫玻片；常規HE染色試劑；中性樹膠；抗體CD3、CD20購自北京中杉金橋公司，二抗和DAB顯色液購自Dako公司；10%中性福爾馬林(成品)、95%乙醇、丙酮、甲醇、改良AAF固定液(15 mL 10%中性福爾馬林、40 mL丙酮、43 mL苦味酸飽和無水乙醇液、2 mL冰醋酸)；將它們分成10%中性福爾馬林組、乙醇組、丙酮組、甲醇組和AAF組。

1.3 方法用OCT膠水將組織環繞包埋覆蓋，置于-18 ℃冷凍臺中速凍約2 min，4 μm厚連續切片15張，快速放入不同固定液中固定2 min(除10%中性福爾馬林為室溫固定外，其它均為低溫固定，低溫固定可以避免溫度驟變引起的細胞變化)，每種固定液3張切片，1張行HE染色，另2張行CD3和CD20染色。HE染色流程為常規的冷凍切片HE染色。免疫組化染色流程：3%雙氧水封閉10 min，PBS沖洗3次，每張切片滴加100 μL一抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加100 μL二抗，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 結果判斷從本科室30名診斷醫師中隨機抽取2名醫師對5組切片染色結果進行雙盲法評分。HE切片根據組織結構、細胞形態、細胞核(質)染色強度、核質對比度進行評分。CD3、CD20免疫組化染色按組織結構、細胞形態、陽性強度、陽性定位、背景染色進行評分。單項滿分為10分，最差為0分，5項檢查合計滿分為50分，若不能滿足臨床診斷則直接記為0分。

2 結果

2.1 HE染色經10%中性福爾馬林固定的切片：鏡下組織結構不清晰，細胞核皺縮，胞質著色不良，核染色和胞質染色對比度差(圖1)。經95%乙醇固定的切片：鏡下可見較清晰的組織結構，但細胞核存在收縮現象，細胞核染色模糊，細胞質染色效果不佳，著色不鮮艷(圖2)。經丙酮固定的切片：鏡下組織結構較清晰，有核溶解現象，胞質染色不佳，核染色和胞質染色對比度尚可。經甲醇固定的切片：鏡下組織結構較完整、清晰，細胞核形態較完整，部分有核溶解現象，胞質染色尚清晰，核染色和胞質染色對比度較好(圖3)。經改良AAF固定的切片：鏡下可以看到清晰的組織結構，細胞核和細胞質染色效果清晰，顏色鮮艷，兩者對比效果明顯(圖4)。

2.2 免疫表型經10%中性福爾馬林固定的切片，CD3、CD20染色均出現不少的假陰性，影響臨床診斷(圖5)。經95%乙醇固定的切片，組織結構較清晰，染色陽性強度和定位較好，背景較清晰(圖6)。經丙酮固定的切片，CD3、CD20均出現較多的非特異性染色。經甲醇固定的切片，組織結構完整清晰，陽性強度和定位較好，背景清晰(圖7)。經改良AAF固定的切片，組織結構完整清晰，陽性強度好，定位準確，背景清晰(圖8)。

2.3 評分在HE、CD3和CD20染色評分中，5組平均得分差異均有統計學意義(P均<0.001)，平均得分AAF>甲醇>乙醇>丙酮>10%中性福爾馬林，進一步兩兩比較，福爾馬林組與其它4組平均得分差異有統計學意義(P均<0.05)；乙醇組與丙酮組平均得分差異無統計學意義(HE中P值為0.73；CD3中P值為0.96；CD20中P值為0.45)；AAF組與其它4組平均得分差異有統計學意義(P均<0.001，表1)。

①②③④⑤⑥⑦⑧

表1 5組不同固定液固定切片染色評分

3 討論

冷凍切片是一種快速制片技術，在外科手術和病理科中較為常見，其將病理組織冷凍至一定硬度后再進行切片處理[1]。冷凍HE切片制作需時間短、質量高，其診斷的準確性影響臨床手術方案的制定。但影響冷凍切片質量的因素較多，其中一項最重要的因素是冷凍切片的固定，因此選擇合適的固定液對冷凍切片的HE染色質量有十分重要的影響[2]。固定作用在于使蛋白變性、凝固、沉淀，保持細胞、組織原有的形態結構，使水溶性物質擴散，抑制酶的活性，保持細胞膜的完整性，防止切片模糊；同時，能使組織中各物質沉淀和凝固后產生不同的折射率，使染色后的切片利于觀察[3]。

淋巴結組織在取材過程中往往會夾雜著較多的脂肪組織，應與取材醫師有效溝通去除診斷無關的脂肪組織，原則上同一凍頭上不要超過3枚淋巴結組織，對于較大的淋巴結應剖開取材[4]。淋巴結組織細胞密集，呈塊狀，細胞核染色深，冷凍切片中淋巴細胞易收縮，給診斷帶來一定難度。因此，決定了淋巴結組織在冷凍切片中對固定液選擇和染色過程中條件選擇的特殊性。

10%中性福爾馬林是HE染色中最常用的固定液之一，但其在冷凍切片中表現欠佳，可能與10%中性福爾馬林成分中含水量較多、無法低溫固定，造成了組織自溶，不適應于對冷凍切片組織進行快速固定的樣本，而石蠟切片對組織緩慢滲透的固定效果良好，免疫組化標記CD3和CD20中均出現不少的假陰性，可能與未進行修復、抗原決定簇封閉有關。乙醇具備固定兼脫水功能，能夠將切片上的水分去除，從而使切片的組織結構得以完好的保存下來，并且能夠使球蛋白、白蛋白、核蛋白完整沉淀，但是核蛋白的沉淀會在水中溶解，從而使著色效果不佳。除此之外，乙醇還會形成一層蛋白膜覆蓋在組織表面，使固定液和染液不能較好地滲入，從而對染色質量產生不良影響[5]。丙酮為單純性固定劑，能使蛋白質沉淀，滲透力強，在一部分組織中對核的固定欠佳，著色不良[6]，在本實驗中細胞核染色淡，收縮明顯，且更容易脫片，CD3和CD20染色均出現較多的非特異性染色。甲醇為沉淀類固定劑，對組織滲透性強，能迅速沉淀清蛋白、球蛋白和核蛋白，甲醇有著乙醇的收縮作用，收縮性比乙醇小[7]，對淋巴結組織的固定有較好的效果，但細胞核仍有收縮，核質對比度還不夠鮮明。改良的AAF固定液是一種復合固定液，由無水乙醇、甲醛、丙酮、冰醋酸、苦味酸按一定比例混合，苦味酸能沉淀一切蛋白質且對組織無明顯硬化作用，甲醛水溶液滲透力強，固定均勻，丙酮和冰醋酸均能使組織膨脹，聯合應用既能抵消乙醇固定引起的組織高度收縮和硬化，又能加速固定，兼備快速脫水和固定作用。本實驗中經改良AAF固定液制作的淋巴結切片組織結構、細胞形態、胞質對比度均優于其它固定液。

綜上所述，改良的AAF固定液能夠顯著提高淋巴結組織冷凍切片的優良率，配置簡單，值得臨床推廣。