一種薄壁類組織的冷凍制片方法

顧維娜

目前，術中快速冷凍切片病理檢查是手術病理診斷中最高效、便捷的方法，與臨床治療緊密聯系，其制作具有質量要求高、診斷者責任重、診斷時間短(30 min內)等特點。因此，制作一張比較完整的冷凍切片對病理診斷極為重要。在實際工作中，對于特殊類型的組織如皮膚、囊壁、胃腸道、子宮腔樣組織等需要豎直包埋于冷凍托上，此類組織壁較薄，因其沒有可依靠物常常會在包埋過程中發生傾斜，導致鏡下組織出現卷曲、折疊，嚴重影響病理醫師的精確診斷。本科室經過多次實踐，研究一種針對此類組織提高冷凍切片質量的可行方法，已通過國家專利審核，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集浙江省寧波市北侖區第二人民醫院手術送檢的新鮮卵巢組織和胃腸道組織。

1.2 試劑與儀器珊頓FE冷凍切片機，普通膠水，95%乙醇、Gill改良蘇木精染液、醇溶性伊紅液、1%鹽酸乙醇分化液。白色熱熔膠棒(直徑0.7 cm)，特制樣本托(即在圓形樣本托的中央制作1個下陷的圓柱形小孔，直徑0.75～0.9 cm，深度為0.3 cm)(圖1、2)。

1.3 制作薄壁類組織的冷凍方法(1)將恒溫冷凍切片機調整至適宜的溫度。(2)在特制的樣本托中央小孔注入少量膠水，放入高度為0.5～0.7 cm的白色熱熔膠棒，置于速凍臺上速凍5 s。(3)將取好的薄壁組織以熱熔膠棒為中心，順時針包繞于熱熔膠棒(圖3)。(4)將已放入組織的樣本托置于速凍臺上，壓上冷凍錘，急速冷凍。(5)調整防卷板與刀刃及刀座之間的角度，將切片厚度調至5 μm，將已冷凍完成后的樣本托固定在切片機的機頭上，調整機頭的位置使其恰好位于切片刀的后方。(6)關閉觀察窗，利用快進鍵和快退鍵調整組織塊與刀刃平行，以粗切削的方式暴露標本的最大平面。(7)掃除組織碎屑，放下放卷板，用力均勻、柔和地搖動冷凍切片機轉輪，開始切片。(8)打開防卷板，用載玻片輕壓組織，使其平整的裱貼到載玻片正中位置上。(9)立即投入到新鮮配置的95%乙醇固定液中，冷凍常規染色，中性樹膠封固，鏡檢。

2 結果

經熱熔膠棒制備的快速冷凍切片鏡下組織完整，厚薄均勻，全層各結構可見，無皺折、卷曲、重疊、冰晶，細胞染色清晰、核質分明、對比度好(圖4)。整個操作過程約7 min。

①②③④

3 討論

冷凍切片技術是快速病理診斷的基石，如何在有限的時間內又快又好地完成制片，不僅是病理診斷的需要，更是術中醫師的迫切要求[1-2]。在日常冷凍切片工作中，對于特殊組織如皮膚、囊壁、胃腸道、宮腔等有極性組織，在冷凍制片包埋中必須注意組織極性，豎立包埋，以確保行全層切片。然而此類組織因壁薄，置于液體膠水中沒有相應的支撐物，在冷凍切片過程中易卷曲、折疊，也有學者將囊壁類組織切成長條后卷曲置于包埋劑中[3]，待包埋劑大部分變白冷凍后再使用冷凍錘，這樣既增加冷凍時間又極易形成冰晶。

針對以上問題，我科室人員在大量實踐中發現，使用熱熔膠棒和特制樣本托能完整快速地制作出優質切片。熱熔膠棒其外觀為白色不透明直徑為0.7 cm圓柱體，以乙烯-醋酸乙烯共聚體為主要材料，加入增粘劑與其他成分配合而成的固體型有機粘合劑，不受細菌、霉菌、寄生蟲的侵蝕。在持續加熱時才會分解，具有無毒、無溶劑，不污染環境，對人體無損害，耐酸、耐溶劑、耐水，不透過水蒸氣，方便剪裁等特點，并且無凍結危險，在冷凍切片機低溫環境中不會變形[4]。其本身具有一定的硬度，能抵抗冷凍錘的壓力，同時還有一定韌性，在切片環節中會隨組織一起以膠膜的形式切下來，膠膜連續，具有良好的黏附性和成膜性，膠膜富有高彈性和柔韌性，且不會損害刀口。

在冷凍切片過程中，將特制的樣本托中央小孔內注入少量膠水，并將高度為0.5～0.7 cm的白色熱熔膠棒插入樣本托中央小孔內，置于冷凍臺上速凍，5 s后膠水已由透明變成白色，熱熔膠棒與樣本托緊密粘連，再將取材好的薄壁類組織以熱熔膠棒為中心，順時針包繞于熱熔膠棒，即以熱熔膠棒作為組織的支撐物。因熱熔膠棒具有一定的硬度，在其后的冷凍錘輕壓組織環節，薄壁類組織不會向一側傾斜，不會造成組織結構的反轉、重疊、扭曲，能全面完整地將此類組織的各層結構顯現；并且熱熔膠棒事先已預冷，薄壁類組織一貼于熱熔膠棒，因溫差幅度大，組織立即貼合于熱熔膠棒四周。冷凍錘及時快速助凍，有效避免冰晶的產生，顯著縮短組織冷凍時間由常規的3 min縮短至75 s。在后續的切片環節，熱熔膠棒會以膠膜的形式隨組織一起切下來，并黏附于載玻片上，置于95%乙醇固定液中，熱熔膠棒膠膜不溶于乙醇等有機溶劑，膠膜會自動脫落，薄壁類組織則完整牢固地貼附于載玻片上，即最終完成的病理切片在顯微鏡下觀察時只出現薄壁類組織，無熱熔膠棒膠膜，并且組織中細胞大小形態正常，核質染色分明，并未出現細胞變性，也未發現脫片等不良問題。

在薄壁類組織術中快速冷凍切片技術中使用熱熔膠棒，其優化操作流程，避免冰晶等不利因素的干擾，顯著提高工作效率，為冷凍切片質量控制提供有力保障。同時提供更全面、更完整的冷凍切片和更充沛的診斷時間，為病理醫師迅速作出正確的診斷打下良好基礎。