熒光染色在隱球菌病石蠟包埋組織中的應用

王 琦，王曉秋，顧 萍，李傳應

隱球菌廣泛存在于土壤、鴿糞和樹洞中，為條件致病菌[1]。隨著HIV感染、抗生素以及免疫抑制劑使用的增加，隱球菌感染逐漸增多。該病主要侵犯中樞神經系統和肺臟，其次是皮膚、腎臟等，起病隱匿，臨床表現復雜多樣，易誤、漏診[2-4]。隱球菌感染的治療與早期正確的診斷密切相關。近年熒光染色在真菌感染的檢測中應用越來越多，但多集中在淺部真菌或體液等新鮮樣本的涂片檢測[5-6]，在石蠟包埋組織中的應用卻鮮有報道。本文收集12例病理診斷的隱球菌病，探索熒光染色在石蠟包埋組織中檢測隱球菌的潛在應用價值，并和特殊染色做比較，以期找出效果最佳的隱球菌顯色方法。

1 材料與方法

1.1 材料選取2017～2019年中國科學技術大學附屬第一醫院存檔的隱球菌感染標本12例，其中肺部感染9例，皮膚感染2例，鼻腔感染1例。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，60 ℃烤片1～2 h。

1.2 方法

1.2.1HE染色 石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇分化，水洗，伊紅染色30 s，常規脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.2熒光染色 石蠟切片脫蠟至水，添加一滴真菌熒光染色液覆蓋于標本上，蓋上蓋玻片，使其與標本充分結合。染色1～2 min，用濾紙吸取玻片周邊多余染液，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3PAS染色 切片脫蠟至水，高碘酸氧化10 min，水洗，Schiff試劑染色10～15 min，流水沖洗，蘇木精復染2 min，常規脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.4六胺銀染色 配制六胺銀工作液：將5滴5%的硝酸銀緩慢加入5 mL 3%的烏洛托品溶液中，邊加邊搖，至白色沉淀溶解，然后加入2 mL 5%的四硼酸鈉溶液，最后加入25 mL蒸餾水，混勻待用。六胺銀染色步驟：切片脫蠟至水，高碘酸氧化10 min，水洗后放入工作液中，65 ℃烤箱染色40～60 min，期間經多次顯微鏡下觀察，0.2%氯化金調色，硫代硫酸鈉固定2 min，伊紅復染，常規脫水透明，中性樹膠封固。

2 結果

4種方法均能染出隱球菌。HE染色：隱球菌呈現隱約的淡紅或淡藍色，有時不著色，輪廓不明顯，圓形或橢圓形，不易觀察(圖1)。熒光染色：隱球菌菌壁呈亮藍色，背景藍黑色，隱球菌結構清晰，反差明顯(圖2)，染色48 h后，菌壁亮藍色減弱(圖3)。PAS染色：隱球菌菌體中間淡染，菌壁呈紫紅色，細胞核顯藍色，背景淡紅色至紅色，反差較弱(圖4)。六胺銀染色：隱球菌呈黑褐色，菌壁四周深黑色，中間為淡染區，用伊紅復染時，背景為紅色(圖5)。

3 討論

隱球菌為酵母型真菌，圓形或橢圓形，直徑3～20 μm，菌體周圍被一厚3～5 μm的強折光性莢膜包繞，由黏多糖物質組成。近年隱球菌感染越來越多，明確診斷對隱球菌病的治療有重要的指導作用。但是該病臨床表現各異，缺乏特征性的影像學表現，診斷具有一定的挑戰性[2-4]。

組織病理學檢查是診斷隱球菌感染的重要手段，在病變組織中查見隱球菌病原體便可確診。常規HE染色有時僅顯示病灶內隱球菌呈淡紅、淡藍或不顯色的圓形空泡狀小體，若醫師經驗少或觀察不仔細，易漏診，常需借助特殊染色進行檢測。PAS染色和六胺銀染色是常用的顯示隱球菌的特殊染色方法。兩種染色均是利用氧化劑氧化隱球菌菌壁的多糖，暴露出醛基，再分別與Schiff試劑或銀離子發生反應，使菌壁呈現出相應的紫紅色或黑色。然而，這兩種染色方法對于所有的真菌孢子均為陽性反應，特異性較差。

真菌熒光染色液是熒光增白劑和氫氧化鉀的混合溶液，熒光增白劑是一種染料，能夠與真菌細胞壁的幾丁質和纖維素特異性結合而使菌體著色，在波長為340～380 nm的紫外光照射下，會發出亮藍色的熒光[7]。熒光染液中的KOH成分不僅可以溶解組織細胞、角蛋白和脂肪等組織碎屑，使組織透明化，還可以去除背景中的干擾熒光，提高與背景的反差。近年熒光染色在真菌感染的檢測中應用越來越多，但多集中在淺部真菌或體液等新鮮樣本的快速檢測，如各種毛發、甲屑、皮屑、痰液、角膜涂片和陰道分泌物等，與傳統的KOH濕片法相比，熒光染色具有敏感性強、陽性率高的特點[5,8]。然而，熒光染色法在石蠟包埋組織中的應用卻鮮有報道。

①②③④⑤

本實驗將熒光染色用于隱球菌病石蠟包埋組織標本的檢測，熒光染色結果和PAS染色及六胺銀染色結果一致，但是熒光染色隱球菌菌壁呈亮藍色，背景呈藍黑色，反差更明顯，菌體結構更清晰。相比之下，PAS染色雖然操作也很簡單，但其還能顯示組織中的糖原、中性黏液、基膜和一些炎癥細胞等，背景呈紅色，與隱球菌紫紅色菌壁反差不明顯，影響結果的判讀，易漏診。六胺銀染色結果反差明顯，背景為紅色，菌壁呈深黑色，隱球菌容易辨認，但是染色操作復雜，整個過程持續時間較長，需多次進行顯微鏡觀察，并且切片易受銀沉淀污染，對玻璃儀器的清潔度要求較高。熒光染色步驟簡單，滴加染液后僅需1～2 min便可進行鏡下觀察，也有報道稱熒光染色標本鏡檢的時間可縮短至30～60 s[9]，大大提高了染色的效率。熒光染色后的切片也可以重復使用，節省了制片的成本。需要注意的是，熒光染色法組織中的彈力纖維以及玻片上存在的少量纖維也可發出熒光[7-8]，但其形態與隱球菌有較大差異，憑經驗一般可以避免假陽性情況的發生。考慮到熒光淬滅快，制片后需盡快進行鏡下觀察和拍照。本實驗發現石蠟包埋組織隱球菌熒光染色后，一般可在暗處存放2～3天，熒光逐漸減弱，背景開始增強。

綜上所述，本實驗證實了熒光染色法在石蠟包埋組織中檢測隱球菌的可行性。該方法操作簡便、快捷省時，染色結果直觀明確。隨著熒光顯微鏡使用的增多，熒光染色法是檢測隱球菌病石蠟包埋組織的一種快速有效方法。