喉與下咽切除標本脫鈣制片的優化處理

王德望，龔金梅，彭麗紅，司明遠，劉 夢，歐陽聰，張夢迪

鈣化組織因含鈣鹽或磷酸鹽多、質地硬，制片前需脫鈣處理，才能制出完整的骨組織或其他硬組織病理切片[1-2]。臨床工作中，組織脫鈣一般以骨組織為材料，通常在脫鈣前將所附軟組織剔除后(僅附少量軟組織)再進行脫鈣處理。喉/下咽腫瘤的病變絕大部分起源黏膜病變，隨病情發展漸累及外周組織及軟骨，因病理診斷的需要，需制作喉/下咽軟硬組織聯合切片。如何制作滿意的喉/下咽軟硬組織聯合切片，對于病理科是個技術挑戰。本科室從脫鈣液配制、組織分階段分切、脫鈣后殘留酸處理等幾個主要方面入手，進行相應的改進，對制作滿意的喉/下咽軟硬組織切片取得良好效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2016年3月～2019年3月東南大學醫學院附屬南京同仁醫院耳鼻咽-頭頸外科手術切除的喉/下咽半切除或全切除標本90余例。

1.2 主要設備切骨刀，全自動組織脫水機，切片機，漂烘儀，染色機等。

1.3 試劑10%中性福爾馬林液，復合酸脫鈣液，85%乙醇溶液。

1.4 方法

1.4.1復合酸脫鈣液配制 甲酸330 mL，16%中性緩沖福爾馬林640 mL，鹽酸10 mL，冰醋酸20 mL。

1.4.2組織固定 標本接收后，用常規10%的中性福爾馬林固定3 h以上，再用切骨刀將喉標本沿縱軸將標本粗切成非完全性離斷組織塊，用復合酸脫鈣液固定。注意事項：(1)組織未經脫鈣不能直接用普通取材刀將組織切成薄塊，因軟組織與軟骨或骨化組織質地不一，切時容易致軟硬組織分離，造成組織撕脫，只能用切骨刀將標本切成粗塊。(2)標本需常規固定一段時間后再行脫鈣，因為組織經過固定后，可減緩酸對組織的損傷，如新鮮組織或組織未經有效固定即行脫鈣處理，則可致紅細胞溶解，制片后易形成含鐵血黃素析出。

1.4.3分階段分切 待鈣化組織軟化，切感比軟組織質地稍硬，但能將軟硬組織切成完整組織塊時，將軟硬組織切成0.3～0.5 cm厚組織片，再將組織塊另裝容器脫鈣24 h，以保證充分脫鈣。特殊標本特別是用于科研的標本，為力求組織的完整性、脫鈣充分，在粗切脫鈣軟化后，也可先切成厚的組織塊，根據實際需要充分脫鈣后再將其修整為常規0.3 cm的組織塊。分階段分切，梯度將組織薄層處理，有利于脫鈣完全(圖1)

1.4.4祛酸處理 組織脫鈣徹底后，需進行祛酸，祛酸如不徹底，組織制片后會導致細胞核染色不佳，嚴重者可使組織切片發灰，影響觀察和診斷[3]。根據我們的經驗，組織徹底脫鈣后，第一天日間適當流水沖洗，夜間再行85%乙醇溶液浸漬，第二天日間再繼續行流水沖冼，全過程約24 h，可保證后期達到滿意的制片效果。

1.4.5常規脫水、制片 喉/下咽切除標本組織塊經脫鈣祛酸后，隨其它組織常規進行脫水、包埋制片。

2 結果

本組采用該方法處理的喉/下咽切除標本，因沒有進行軟骨的剔除，組織結構完整，喉黏膜、韌帶、肌組織及伴或不伴骨化的軟骨一應俱全，易于判斷腫瘤的侵犯層次。同時，由于組織分階段分切、脫鈣，其脫鈣徹底，組織完整，無脫鈣不完全制片后的組織空洞形成。組織祛酸徹底，HE染色色澤鮮艷，與常規非脫鈣組織無明顯區別(圖2～4)，而無脫鈣后祛酸處理不佳的組織切片發紅，核不著色的現象。

3 討論

喉/下咽管壁本身及外周均有較硬的鈣化組織或伴有不完全鈣化的軟骨組織，喉/下咽腫瘤大多來源于黏膜，起源于黏膜的惡性腫瘤隨病情發展逐漸向深層、外周組織(如甲狀軟骨)侵犯，侵犯層次越深，或累及外周組織越廣泛，則臨床分期越高，預后則越差[3-4]。因此，喉/下咽腫瘤標本應進行脫鈣處理，觀察腫瘤對外周及軟骨的侵犯，嚴格進行病理分期，為臨床醫師提供更多診斷信息以利于充分進行預后評估。

①②③④

目前尚未有喉/下咽軟硬組織脫鈣處理的文獻報道，喉/下咽軟硬組織聯合脫鈣難度較高，可能主要受以下幾方面因素影響：(1)喉/下咽管壁及外周均有軟骨，但其硬化程度比真正的骨質鈣化程度低，常用的骨標本脫鈣液并不完全適用喉標本脫鈣，因其濃度較高，易損傷組織。(2)喉/下咽軟硬組織的組織致密度、硬度不一，不能像骨組織一次性鋸成常規取材所需的0.3～0.5 cm組織塊。(3)現階段對于組織脫鈣后祛酸處理主要是對硬組織的研究，較少關注到軟硬組織整體脫鈣后，軟組織中易蓄積酸性脫鈣液。

本組復合酸脫鈣液以弱酸為主，配以低濃度的強酸為輔，并輔以穿透性強，且具有一定組織膨脹作用的冰乙酸，脫鈣效果比單純弱酸脫鈣液快，對組織的損傷比單純強酸脫鈣液小[5]。喉/下咽軟硬組織制片不適合簡便操作，強行一次性分切會導致軟硬組織相互分離，只有分階段分切，將組織梯度薄層處理，才有利于保持組織的完整性及脫鈣徹底。多數文獻報道[6-7]經弱酸脫鈣后的組織流水沖洗30 min即可，但我們發現喉軟硬組織脫鈣后一般需沖洗24 h效果較好，而30 min的沖冼時間過短會影響制片后的著色效果，可能大多數脫鈣研究的資料為分離軟組織后的骨組織，組織中含酸相比軟組織中含量較少有關。另外，筆者發現脫鈣后組織如沖洗不充分，直接進入脫水程序，如脫鈣組織塊多、含酸量多的情況下，則會污染整批次的組織，導致染色效果差。根據脫水原理，我們認為可能乙醇在脫水的過程中將組織內的酸隨脫水而釋放出來。因此，我們在流水沖洗過程中特意設置一個重要環節，在組織脫鈣后流水沖洗祛酸的環節中增加乙醇溶液浸漬過程，該過程的改良可以使祛酸更徹底，同時比夜間流水沖冼更安全。

本組采用喉/下咽標本的處理獲得較好的制片效果，有利于臨床病理診斷和腫瘤分期，但整個組織處理時間較長，而使診斷周期偏長。有研究表明脫鈣過程中聯合使用超聲波技術可加快分子運動[8-9]，預計可加速組織脫鈣及祛酸過程，從而縮短組織脫鈣處理過程。本實驗僅限于喉/下咽切除標本的軟硬組織HE常規制片效果觀察，對其脫鈣祛酸后殘留酸的客觀判定以及軟硬組織聯合制片的免疫組化染色效果等未作深入分析，后期我們將進一步深入探討，為病理制片提供參考。