胃腺癌中RAI14的表達及其臨床意義

楊苗苗，王岳君，王 源，王娜娜，章俊生，黃偉超，陳國棟，孟 剛,4

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤,發病率和病死率均位居惡性腫瘤的前列,據國家癌癥登記中心(NationalCentralCancerRegistry,NCCR)的調查結果顯示,我國每年新發病例數約41萬,死亡病例數約29萬[1]?目前針對胃癌的分子靶向治療研究多集中在抗HER2單抗[2]和抗VEGF單抗,但由于胃癌相關蛋白表達強度及表達細胞存在高度異質性導致單分子靶向藥物的治療存在局限性[3],因此,尋找能夠抑制胃癌進展和轉移的新分子靶點有望促進腫瘤治療新策略的制定?維甲酸誘導蛋白14(retin-oic acid induced protein 14, RAI14)是一種首先于人視網膜色素上皮中被發現的蛋白質編碼基因，在人的胎盤和睪丸組織中亦存在高表達，與細胞骨架相關，在卵巢癌[4]、胃癌[5]及肺腺癌[6]中的研究表明其與腫瘤細胞的增殖和侵襲密切相關。本文采用免疫組化法檢測胃腺癌組織中RAI14的表達及其與臨床病理特征的關系，并與TCGA數據庫樣本分析結果進行對比，以期進一步探討RAI14與胃癌發生、發展的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017～2019年安徽醫科大學第四附屬醫院行胃癌根治術切除的有完整資料的58例胃浸潤性腺癌標本，其中男性45例，女性13例，患者年齡26～84歲，平均66歲。所有病例均經本院兩位高年資病理醫師復核確診并排除原位癌病例。

1.2 TCGA數據庫樣本分析UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一個有效的癌癥數據在線分析和挖掘的網站，主要是基于TCGA數據庫中的相關癌癥數據，對基因進行biomarker鑒定、表達譜分析，生存分析等。

1.3 方法標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋切片。免疫組化染色采用EliVision兩步法，兔抗人RAI14單克隆抗體購自Abcam公司，工作濃度1 ∶100，EliVision檢測試劑盒購自羅氏公司。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。胎盤組織中RAI14的染色作為陽性對照，PBS代替一抗作為空白對照，DAB顯色，蘇木精襯染。

1.4 結果判斷免疫組化結果判定由兩位高年資病理醫師通過雙盲法獨立閱片。RAI14陽性為胞質和(或)胞膜出現棕黃色顆粒，參考文獻[7-8]中的判讀標準，根據細胞著色強度計分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據陽性細胞所占百分比進行計分：陽性細胞數<1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；將兩項得分結果相乘：≤4分為低表達組，>4分為高表達組。

1.5 統計學分析采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，RAI14的表達在胃腺癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中的差異及與各臨床病理特征的關系均采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCGA數據庫中胃腺癌中RAI14的表達差異及生存分析對TCGA數據庫中415例胃腺癌及34例正常胃黏膜樣本進行分析，結果顯示胃腺癌組與正常胃黏膜組織相比，RAI14呈高表達；進一步的生存分析結果顯示，RAI14高表達的胃腺癌患者生存期較短(圖1)，提示RAI14可能是胃腺癌診斷及預后的潛在標志物。

2.2 胃腺癌和癌旁正常胃黏膜組織中RAI14的表達58例胃腺癌組織中有34例(58.6%)高表達RAI14，癌旁正常胃黏膜組織中僅13例(22.4%)高表達RAI14，兩組陽性率差異有顯著性(P<0.001，表1，圖2)。

表1 胃腺癌和癌旁正常胃黏膜組織中RAI14的表達[n(%)]

2.3 胃腺癌中RAI14表達與臨床病理特征的關系胃腺癌中RAI14的表達與腫瘤大小、分化程度、脈管侵犯、淋巴結轉移以及腫瘤分期存在相關性(P<0.05)，在Lauren分型中腸型腺癌與彌漫型及混合型腺癌中的表達差異有顯著性，結果顯示腸型腺癌表達率低(圖3)，而彌漫型及混合型腺癌表達率較高(圖4)，同時對于有脈管侵犯(圖5)、淋巴結轉移及TNM分期較晚者表達率高。與患者年齡、性別無相關性，而且在神經侵犯的癌組織中，RAI14高表達者占68.7%，提示可能具有臨床意義，但與無神經侵犯者相比，兩者RAI14的陽性率差異無顯著性(表2)。

圖1 A.TCGA數據庫中胃腺癌和正常胃黏膜組織中RAI14的表達差異；B.TCGA數據庫中胃腺癌患者基于RAI14表達高低的生存分析

3 討論

RAI14是新發現的蛋白質編碼基因，又稱NORPEG，2001年發現于全反式維甲酸誘導的人視網膜色素上皮細胞中[9]。隨后的研究[10-11]表明RAI14是肝臟中的一種肌動蛋白結合蛋白，同時在人類睪丸中被發現，并在人類精子中高度表達。在人類中，RAI14存在三種選擇性剪接亞型，并與細胞骨架、F肌動蛋白應力纖維和細胞黏附位點等相關。

2013年，Qian等[12]發現在大鼠睪丸的支持細胞和生殖細胞中存在RAI14的高表達，是構成細胞質特化的重要組成成分，參與血睪屏障形成。敲除RAI14相關基因能破壞肌動蛋白并擾亂細胞間的緊密連接；同時在精子形成過程中RAI14能調節精子細胞極性和精子細胞轉運。

②③④⑤

Hsu等[13]通過全基因組分析，發現RAI14是與癌細胞侵襲能力與抗藥能力相關的8個基因(EGFR、ITGA3、MYLK、RAI14、AHNAK、GLS、IL32和NNMT)中的1個，與紫杉醇、多西紫杉醇、厄洛替尼的藥物敏感存在相關性；在Chen等[5]的研究中發現RAI14基因敲除能抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Yuan等[6]研究發現，RAI14的高表達能抑制肺腺癌細胞的增殖。上述研究結果顯示，RAI14可能是癌癥治療的新靶點。

本組實驗通過觀察RAI14在胃腺癌組織及癌旁正常胃黏膜中的表達差異，發現有58.6%的胃腺癌組織高表達RAI14，癌旁正常胃黏膜組織中的高表達率僅有22.4%，兩者差異有顯著性，這與TCGA數據庫分析結論一致，提示RAI14可能在胃癌的發生、發展過程中具有一定的促進作用。目前關于RAI14的表達與腫瘤臨床病理特征的關系研究較少，國內He等[14]研究68例胃癌組織中RAI14的表達，認為胃癌組織中RAI14的高表達與不良預后有關。本組數據顯示，RAI14表達與患者年齡、性別無相關性，RAI14在腫瘤直徑>5 cm、分化程度較低、有脈管侵犯和淋巴結轉移以及進展期胃腺癌中的陽性率較高且差異有統計學意義，同時發現按照Lauren分型顯示，腸型腺癌與彌漫型及混合型腺癌中RAI14的表達也具有相關性，提示RAI14可能與癌細胞的增殖、侵襲及遷移密切相關，參與胃癌的進一步惡化，這與TCGA數據庫生存分析顯示RAI14高表達患者生存期較短一致。本組隨訪顯示，8例死亡，其中4例為RAI14高表達患者，因隨訪時間較短，仍需長期隨訪對其生存期進行分析。本組數據結果顯示，具有神經侵犯的腺癌患者雖然有68.7%的高表達率，但與缺乏神經侵犯病例的RAI14表達差異無統計學意義，有待增加樣本量進行深入探討。

表2 胃腺癌中RAI14的表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

總之，本組實驗結果表明，RAI14基因在胃腺癌中高表達，主要表達于腫瘤直徑較大、分化較差的彌漫型和混合型腺癌以及具有脈管侵犯、淋巴結轉移、TNM分期較晚的胃癌組織中，說明RAI14的高表達提示腫瘤有較強的侵襲性，并伴有較短的生存期。RAI14可能是胃癌未來潛在的新治療靶點。