leptin和HIF-1α對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者預(yù)后影響的研究

葉颯 王飛燕 周宏斌

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是呼吸系統(tǒng)的常見(jiàn)疾病，是全球第三大死亡原因疾病，造成了巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。COPD以持續(xù)性呼吸道氣流受限和急性加重為特征，氣流受限通常是漸進(jìn)性的，與呼吸道慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)[3]。關(guān)于COPD的病理機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為炎癥機(jī)制、蛋白酶和抗蛋白酶失衡機(jī)制、氧化應(yīng)激機(jī)制、自主神經(jīng)功能失調(diào)和營(yíng)養(yǎng)不良等參與COPD的發(fā)生、發(fā)展[4-6]，其中炎癥機(jī)制仍是當(dāng)前臨床研究的焦點(diǎn)。COPD發(fā)病有多種細(xì)胞因子參與。瘦素（leptin）是一種多效性細(xì)胞因子，主要由脂肪細(xì)胞分泌，leptin信號(hào)在下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌中起著重要作用，它控制食欲和能量的平衡。COPD患者存在體重減輕、食欲不振等問(wèn)題，可能與leptin有關(guān)[7]。缺氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α）是缺氧平衡的主要調(diào)節(jié)因子，COPD患者因缺氧可誘導(dǎo)HIF-1α持續(xù)表達(dá)，在HIF-1α及其下游的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的作用下促進(jìn)肺血管重塑[8-9]。leptin作為炎癥調(diào)節(jié)因子，對(duì)VEGF起著正向調(diào)節(jié)作用，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中可誘導(dǎo)磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C信號(hào)通路激活HIF-1α，從而促進(jìn)VEGF的表達(dá)，加速COPD的進(jìn)程[10]。目前l(fā)eptin和HIF-1α與COPD的關(guān)系尚不明確，本研究通過(guò)分析COPD患者血清leptin和HIF-1α水平與各項(xiàng)臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系，探討血清leptin和HIF-1α水平對(duì)COPD患者預(yù)后的影響。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2013年8月至2016年8月在浙江省人民醫(yī)院診治的穩(wěn)定期COPD患者83例（COPD組），其中男 55 例，女 28 例；年齡 58～91（73.95±7.93）歲；BMI（20.86±3.01）kg/m2；吸煙 50例（60.24%），不吸煙 33例（39.76%）。所有入組患者均符合2019年COPD全球倡議（GOLD）指南中的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)支氣管擴(kuò)張劑治療后，行肺功能檢查，第一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）/用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）＜0.70，并根據(jù)FEV1%將患者分為GOLD 1～4級(jí)。1級(jí)：FEV1≥80%預(yù)計(jì)值，2級(jí)：50%≤FEV1＜80%預(yù)計(jì)值，3 級(jí)：30%≤FEV1＜50%預(yù)計(jì)值，4 級(jí)：FEV1＜30%預(yù)計(jì)值；（2）患者的咳嗽、咳痰和氣促等臨床表現(xiàn)較穩(wěn)定，或只是表現(xiàn)出輕微的癥狀，病情基本恢復(fù)到急性加重前的狀態(tài)；（3）無(wú)咳膿性痰、發(fā)熱等，無(wú)WBC或中性粒細(xì)胞百分比增高，無(wú)肺炎的影像學(xué)證據(jù)；（4）定期門診或電話隨訪30個(gè)月以上獲取生存時(shí)間。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）COPD急性加重；（2）合并間質(zhì)性肺病、哮喘、肺結(jié)核、肺炎、肺癌等器質(zhì)性疾病；（3）合并糖尿病、嚴(yán)重心腦血管疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或肝腎功能障礙；（4）合并精神疾病、認(rèn)知功能障礙和溝通障礙；（5）合并其他腫瘤。另選取同期本院體檢中心的健康體檢者45例作為正常對(duì)照組，其中男29例，女 16 例；年齡 58～87（72.67±7.25）歲；BMI（22.78±3.58）kg/m2；吸煙 27例（60.00%），不吸煙18例（40.00%）。兩組受試者性別、年齡和吸煙率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但兩組受試者BMI比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清leptin和HIF-1α水平檢測(cè) 確認(rèn)符合納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)后，收集受試者外周靜脈血2 ml，加入抗凝試管中，1 500 r/min離心10 min，分離上清液后-80°C保存。采用ELISA法檢測(cè)所有受試者血清leptin和HIF-1α水平，嚴(yán)格按照試劑盒（leptin批號(hào)：p175117，HIF-1α批號(hào)：p210202，美國(guó)R&D生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書操作。采用MD550酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio－Rad公司）檢測(cè)吸光度（A值）的變化，于酶標(biāo)儀450 nm讀取結(jié)果，570 nm進(jìn)行矯正。根據(jù)Breyer等[12]的方法，將血清leptin水平除以BMI以消除其影響。

1.2.2 COPD組病情嚴(yán)重程度的綜合性評(píng)估

1.2.2.1 GOLD分級(jí) 見(jiàn)1.1對(duì)象中納入標(biāo)準(zhǔn)（1）。

1.2.2.2 改良版英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)（modified British Medical Research Council，mMRC）呼吸困難問(wèn)卷評(píng)分采用mMRC呼吸困難問(wèn)卷對(duì)COPD組患者進(jìn)行評(píng)分。0級(jí)：劇烈活動(dòng)時(shí)出現(xiàn)呼吸困難；1級(jí)：平地快步行走或爬緩坡時(shí)出現(xiàn)呼吸困難；2級(jí)：由于呼吸困難，平地行走時(shí)比同齡人慢或需要停下來(lái)休息；3級(jí)：在平地行走100 m左右或數(shù)分鐘后即需要停下來(lái)喘氣；4級(jí)：因嚴(yán)重呼吸困難而不能離開家，或在穿衣脫衣時(shí)即出現(xiàn)呼吸困難[13]。

1.2.2.3 急性加重風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 上一年發(fā)生2次或以上急性加重，提示今后急性加重風(fēng)險(xiǎn)增加。

1.2.2.4 COPD組病情嚴(yán)重程度的綜合性評(píng)估 根據(jù)GOLD分級(jí)、mMRC呼吸困難問(wèn)卷評(píng)分及上一年急性加重次數(shù)進(jìn)行綜合性評(píng)估分組：A組：GOLD分級(jí)1～2級(jí)，上一年急性加重次數(shù)≤1次，mMRC分級(jí)0～1級(jí)；B組：GOLD分級(jí)1～2級(jí)，上一年急性加重次數(shù)≤1次，mMRC分級(jí)≥2級(jí)；C組：GOLD分級(jí)3～4級(jí)，上一年急性加重次數(shù)≥2次，mMRC分級(jí) 0～1級(jí)；D 組：GOLD 分級(jí) 3～4級(jí)，上一年急性加重次數(shù)≥2次，mMRC分級(jí)≥2級(jí)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)或Spearman秩相關(guān)。不同血清leptin/BMI、HIF-1α水平COPD患者生存時(shí)間的比較采用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗(yàn)；影響COPD組患者預(yù)后的多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者leptin/BMI和HIF-1α水平比較 COPD組患者leptin/BMI和HIF-1α水平均明顯高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 兩組受試者leptin/BMI和HIF-1α水平比較

2.2 COPD組病情嚴(yán)重程度的綜合性評(píng)估分組 83例COPD患者中，mMRC呼吸困難問(wèn)卷評(píng)分1分 7例，2分38例，3分29例，4分9例；GOLD分級(jí)：1級(jí)16例，2級(jí)30例，3級(jí)29例，4級(jí)8例；上一年急性加重次數(shù)≤1次為51例，≥2次為32例。根據(jù)2019年Gold指南，按GOLD分級(jí)、mMRC呼吸困難問(wèn)卷評(píng)分及上一年急性加重次數(shù)進(jìn)行綜合性評(píng)估分組，83例COPD組患者分為A組12例，B組37例，C組5例，D組29例。

2.3 COPD組不同臨床特征患者血清leptin/BMI和HIF-1α水平比較 COPD組患者中，年齡較大、GOLD分級(jí)高、mMRC呼吸困難問(wèn)卷評(píng)分高、上一年急性加重次數(shù)≥2次、病情嚴(yán)重程度較重的患者leptin/BMI水平明顯較高（均 P＜0.05）；吸煙、GOLD分級(jí)高、mMRC呼吸困難問(wèn)卷評(píng)分高、上一年急性加重次數(shù)≥2次、病情嚴(yán)重程度較重的患者HIF-1α水平明顯較高（均P＜0.05），見(jiàn)表 2。

表2 COPD組不同臨床特征患者血清leptin/BMI和HIF-1α水平比較

2.4 相關(guān)性分析 COPD組患者血清leptin/BMI水平和HIF-1α水平呈正相關(guān)（r=0.64，P＜0.01）。COPD組患者血清leptin/BMI、HIF-1α水平和FEV1%[COPD患者FEV1%為（57.75±19.94）%]均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.59和-0.45，均P＜0.01），與mMRC呼吸困難問(wèn)卷評(píng)分[COPD組患者mMRC呼吸困難問(wèn)卷評(píng)分為（2.04±0.80）級(jí)]均呈正相關(guān)（r=0.40和0.22，均P＜0.05），與上一年急性加重次數(shù)[COPD組患者上一年急性加重次數(shù)為（1.66±1.00）次]呈正相關(guān)（r=0.75和0.53，均P＜0.01）。COPD組患者血清 leptin/BMI、HIF-1α水平與病情嚴(yán)重程度均呈正相關(guān)（r=0.48和 0.73，均 P＜0.01）。

2.5 不同血清leptin/BMI、HIF-1α水平COPD患者生存時(shí)間的比較 根據(jù)血清leptin/BMI水平的中位數(shù)（0.38 μg/L），將CODP組患者分為leptin/BMI水平＞0.38 μg/L 組 41例和 leptin/BMI水平≤0.38 μg/L 組 42例。其中l(wèi)eptin/BMI水平≤0.38 μg/L組生存時(shí)間為29.05（95% CI：28.12～29.98）個(gè)月，leptin/BMI水平＞0.38 μg/L 組生存時(shí)間為 25.39（95% CI：23.54～27.24）個(gè)月，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.43，P＜0.01），見(jiàn)圖1。根據(jù)血清HIF-1α水平的中位數(shù)（80.6 ng/L），將CODP組患者分為HIF-1α水平＞80.6 ng/L組42例和HIF-1α水平≤80.6 ng/L組41例。其中HIF-1α水平≤80.6 ng/L 組生存時(shí)間為 28.31（95% CI：27.24～29.38）個(gè)月，HIF-1α水平＞80.6 ng/L組生存時(shí)間為26.15（95% CI：24.26～28.04）個(gè)月，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.58，P＞0.05），見(jiàn)圖 2。

圖1 不同血清瘦素（leptin）/BMI水平慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的生存曲線（a為 leptin/BMI≤0.38 μg/L；b 為 leptin/BMI＞0.38 μg/L）

圖2 不同血清缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）水平慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的生存曲線（a為HIF-1α≤80.6ng/L；b為HIF-1α＞80.6 ng/L）

2.6 影響COPD組患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示，血清leptin/BMI及FEV1%是影響COPD組患者預(yù)后的因素（均P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 影響COPD組患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

3 討論

COPD是進(jìn)行性氣流受限不可逆的慢性氣道炎癥性疾病，其主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的呼吸困難，細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)在COPD的病理生理過(guò)程中起著重要作用。leptin與HIF-1α在許多慢性炎癥性疾病中發(fā)揮了作用，而它們與COPD預(yù)后的關(guān)系及機(jī)制目前尚不明確。筆者通過(guò)檢測(cè)穩(wěn)定期COPD患者的血清leptin和HIF-1α水平，尋找它們和臨床指標(biāo)的關(guān)系，試圖揭示它們?cè)贑OPD病情發(fā)展及預(yù)后中的重要意義。

肺臟中存在著功能性leptin受體，肺部炎癥時(shí)leptin水平升高，提示leptin在呼吸系統(tǒng)疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用。Breyer等[12]研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者血清leptin水平和CRP均顯著升高，兩者之間有著相關(guān)性，由于BMI差異會(huì)影響血清leptin水平，BMI越高leptin水平越高，在矯正BMI差異后，發(fā)現(xiàn)leptin/BMI與CRP的相關(guān)性更加明顯。本研究發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，穩(wěn)定期COPD患者BMI明顯降低，參照以上方法，本研究采用leptin/BMI代替leptin以矯正BMI的干擾。本研究發(fā)現(xiàn)COPD組患者血清leptin/BMI明顯高于正常對(duì)照組，且血清leptin/BMI與FEV1%呈負(fù)相關(guān)，與上一年急性加重次數(shù)呈正相關(guān)，提示leptin可能是COPD病情進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志。

在人體內(nèi)leptin的分泌主要受食物攝入的慢性刺激所控制，它被認(rèn)為是一種與能量代謝環(huán)境適應(yīng)有關(guān)的激素。體外研究表明leptin能通過(guò)PI3K/絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑激活HIF-1α加重氣道炎癥反應(yīng)且這種作用在缺氧的狀態(tài)下更明顯[14]。隨著病情的進(jìn)展，COPD患者低氧血癥逐漸惡化，骨骼肌的糖代謝異常導(dǎo)致leptin表達(dá)增加，而leptin水平增加，則導(dǎo)致患者食欲減退，攝入減少，BMI下降，呼吸肌力下降，最終導(dǎo)致肺功能下降。另有體外實(shí)驗(yàn)表明leptin可通過(guò)NF-κB使VEGF和IL-6 RNA轉(zhuǎn)錄增加，從而促進(jìn)肺血管重構(gòu)，加重炎癥損傷[10]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)COPD組患者血清HIF-1α水平明顯高于正常對(duì)照組，其水平與患者的FEV1%呈負(fù)相關(guān)，與上一年急性加重次數(shù)呈正相關(guān)，說(shuō)明HIF-1α水平亦與COPD的病情發(fā)展密切相關(guān)。HIF-1α是一種炎癥調(diào)節(jié)因子，可被多種炎癥因子通過(guò)PI3K/Akt/mTOR途徑激活，而HIF-1α水平增高會(huì)導(dǎo)致TNF-α、IL-1b和IL-19等炎癥因子的表達(dá)，加重氣道的炎癥狀態(tài)。文獻(xiàn)報(bào)道在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，NF-κB可通過(guò)激活HIF-1α促進(jìn)COPD病情的發(fā)展[15]。本研究中吸煙患者血清HIF-1α水平較高，與Bewley等[16]研究一致，表明吸煙促進(jìn)COPD的發(fā)展可能與吸煙導(dǎo)致HIF-1α水平增加，促進(jìn)氣道炎癥有關(guān)。相關(guān)性分析顯示COPD組患者血清leptin/BMI水平和HIF-1α水平呈正相關(guān)，leptin/BMI和HIF-1α水平不僅與COPD患者FEV1%呈負(fù)相關(guān)，還與按病情嚴(yán)重程度（mMRC呼吸困難問(wèn)卷評(píng)分、肺功能分級(jí)及上一年急性加重次數(shù)）的綜合性評(píng)估分組呈正相關(guān)，表明leptin/BMI和HIF-1α表達(dá)之間存在密切聯(lián)系，兩者不僅與COPD患者肺功能惡化相關(guān)，還與COPD患者的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)生存分析及Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析進(jìn)一步揭示了leptin/BMI、HIF-1α和臨床指標(biāo)對(duì)COPD患者預(yù)后的影響，結(jié)果表明患者leptin/BMI、FEV1%與COPD患者預(yù)后顯著相關(guān)，leptin/BMI低的患者預(yù)后較好，在隨訪期間死亡風(fēng)險(xiǎn)較低，而HIF-1α與預(yù)后的關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。leptin/BMI與COPD患者的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)密切相關(guān)，研究表明營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)差的患者呼吸肌肌力下降，抗感染能力差，導(dǎo)致預(yù)后不良，而糾正營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)后患者的預(yù)后可得到顯著改善[17]。因此leptin/BMI或許可以作為判斷患者COPD預(yù)后的一個(gè)臨床指標(biāo)。

綜上所述，本研究證明COPD患者血清leptin/BMI和HIF-1α水平明顯增高，且leptin/BMI和HIF-1α兩者水平呈正相關(guān)。COPD患者血清leptin/BMI、HIF-1α與FEV1%均呈負(fù)相關(guān)，還與按病情嚴(yán)重程度（mMRC呼吸困難問(wèn)卷評(píng)分、肺功能分級(jí)及上一年急性加重次數(shù)）的綜合性評(píng)估分組呈正相關(guān)。因此，本研究推測(cè)血清leptin/BMI和HIF-1α可能與COPD病情發(fā)展密切相關(guān)，leptin/BMI水平高的COPD患者預(yù)后較差。