不同劑量萬古霉素與髂骨植骨混合對腰椎融合動物模型生物力學的影響

劉斌 王華富 甘維 金掌 崔國鵬

近年來隨著人口老齡化的加劇，進行性腰椎疾病的發病率逐年上升。主要包括腰椎間盤突出癥并發節段性不穩、腰椎管狹窄、腰椎滑脫等，會引起慢性腰腿痛、下肢麻木、間隙性跛行等，嚴重影響患者的生活質量[1]。目前腰椎融合術是臨床治療腰痛和脊柱失穩的重要手段，萬古霉素與自體骨顆粒混合植骨在腰椎融合術中得到了較好的應用，可顯著減少切口感染率[2-3]，但關于萬古霉素與自體顆粒骨混合植骨是否會影響植骨愈合及萬古霉素與自體顆粒骨的最佳混合比例等均未見相關報道。因此，本研究通過比較不同劑量萬古霉素與髂骨植骨混合對腰椎融合動物模型生物力學的影響，篩選出萬古霉素與髂骨植骨（骨顆粒2 g）的最佳混合比例，為臨床應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及儀器 健康成年雄性新西蘭大白兔78只，體重 2.0～2.5 kg，月齡 6～10 個月，由杭州余杭科聯兔業有限公司提供，許可證號：SCXK（浙）2017-0004，合格證號：1805160014，術前適應性喂養1周，確定其健康且無畸形。0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業有限公司，批號：3815101404）；注射用青霉素鈉（華北制藥集團動物保健品有限公司，批號：160401）；碘溶液（南陽市衛達消毒制品有限公司，批號：20160702）；萬古霉素（禮來蘇州制藥有限公司，批號：C837816）；伊紅（美國Sigma公司，批號：62R80915X，）；麗春紅（美國 Sigma公司，批號：041M1341V）；磷鉬酸（杭州藍博有限公司，批號：20160317）；苯胺藍（美國Sigma公司，批號：MKBJ7803V）。生物力學測試儀（型號：2716-020，美國英斯特朗公司）；Micro-CT檢查儀（瑞士SCANCO MEDICAL AG公司）；冰柜（日本三洋MDF-382E型）。

1.2 實驗分組及造模 78只大白兔采用隨機數字表法選取6只納入正常組；根據萬古霉素劑量，另外72只采用隨機數字表法分為模型組、萬古霉素125 mg組、萬古霉素250 mg組和萬古霉素500 mg組，每組18只，進行L5～L6節段雙側橫突間植骨后外側融合造模。造模方法：新西蘭大白兔術前禁食12 h，禁水2 h，用3%戊巴比妥鈉溶液按1 ml/kg腹腔注射麻醉成功后，切開皮膚，從肌間隙進入，顯露L5～L6橫突，橫突去皮質化，取同側髂骨2 g剪成骨顆粒后植骨。模型組、萬古霉素125 mg組、萬古霉素250 mg組和萬古霉素500 mg組在骨顆粒中分別混合不同劑量（0、125、250、500 mg）萬古霉素進行 L5～L6節段雙側橫突間植骨后外側融合。術后每日肌肉注射青霉素160萬U，連續3 d。

1.3 檢測項目及方法 術后4、8、12周，正常組各處死2只，模型組、萬古霉素125 mg組、萬古霉素250 mg組和萬古霉素500 mg組各處死6只。取融合段腰椎組織進行生物力學檢測，包括融合段腰椎組織前屈、后伸、左右側屈、左右旋轉活動度（rang of motion，ROM）值、最大載荷和彈性模量。術后8周對融合段腰椎組織進行組織學和Micro-CT檢查。

1.3.1 生物力學檢測 將標本剔除脂肪、肌肉等軟組織，保留韌帶、關節囊、椎間盤及骨性結構，雙層塑料袋密封保存于-20℃冰柜中備用。測試前24 h解凍骨組織，標本用聚甲基丙烯酸甲酯包埋固定后取L4～L7椎體，將其上下終板修整齊后固定在生物力學測試儀上。然后通過生物力學測試儀在L5～L6椎體融合處進行加載，位移速度5 mm/min，模擬腰部三維活動，檢測融合段腰椎組織前屈、后伸、左右側屈、左右旋轉的ROM值、最大載荷和彈性模量。

1.3.2 組織學檢查 融合段腰椎組織采用4%多聚甲醛固定、鹽酸脫水后，石蠟包埋，切片厚4 μm，HE染色、Masson染色后光鏡下觀察。

1.3.3 Micro-CT檢查 取融合段腰椎組織，置于4%多聚甲醛中固定。掃描條件為源電壓70 kV，電流200 μA，曝光時間300 ms，分辨率10 μm。應用Evaluation V6.5-3分析軟件對腰椎掃描圖片進行三維重建，選取融合區域進行定量分析。分析指標包括掃描骨體積（TV）、感興趣區域骨體積（BV）、相對骨體積（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）和骨密度（BMD）。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建模后各組白兔生物學力學檢測結果的變化與比較 與正常組比較，模型組、萬古霉素125 mg組、萬古霉素250 mg組和萬古霉素500 mg組術后8、12周前屈、后伸、左右側屈、左右旋轉ROM值均減少，術后4、8、12周最大載荷均增加，彈性模量均減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與模型組比較，萬古霉素250 mg組和萬古霉素500 mg組術后8、12周前屈、后伸、左右側屈、左右旋轉ROM值均減少，術后4、8、12周最大載荷均減少，彈性模量均增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與萬古霉素125 mg組比較，萬古霉素250 mg組和萬古霉素500 mg組術后 8、12周前屈、后伸、左右側屈、左右旋轉ROM值均減少，術后4、8、12周最大載荷均減少，彈性模量均增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 1～2。

2.2 4組建模白兔融合段腰椎組織術后8周組織學檢查結果 模型組表現為上下椎體間可見清晰纖維環及髓核，未見新生軟骨；萬古霉素125 mg組表現為上下椎體間可見清晰纖維環及髓核，軟骨變薄，但排列較亂；萬古霉素250 mg組表現為椎間隙可見部分新生軟骨，軟骨變硬，骨小梁增生明顯；萬古霉素500 mg組椎間隙可見部分新生軟骨，部分軟骨化骨，見圖1（插頁）。

2.3 建模后各組白兔融合段腰椎組織術后8周Micro-CT檢查結果比較 與正常組比較，術后8周模型組、萬古霉素125 mg組、萬古霉素250 mg組、萬古霉素500 mg 組 BV/TV、Tb.Th、Tb.N、BMD 均降低，Tb.Sp 升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與模型組比較，萬古霉素250 mg組、萬古霉素500 mg組BV/TV、Tb.Th、Tb.N、BMD 均升高，Tb.Sp降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與萬古霉素125 mg組比較，萬古霉素 250 mg組、萬古霉素 500 mg組 BV/TV、Tb.Th、Tb.N、BMD均升高，Tb.Sp降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。Micro-CT三維重建圖顯示萬古霉素250mg組和萬古霉素500 mg組融合效果優于萬古霉素125 mg組及模型組，見圖2。

表1 建模后各組白兔融合段腰椎組織前屈、后伸、左右側屈、左右旋轉ROM值的變化與比較（cm）

表2 建模后各組白兔融合段腰椎組織最大載荷及彈性模量的變化與比較

3 討論

目前臨床上最常用的腰椎融合術是椎間融合器聯合自體顆粒骨植骨融合，自體髂骨具有良好的成骨性、骨誘導性、骨傳導性及組織相容性。但術中從髂骨處取出植入到椎體間，因有暴露時間，增加了椎間隙感染概率，一旦發生椎間隙感染，抗菌藥物應用療程至少3個月，嚴重者需要再次翻修手術，給患者帶來嚴重負擔。椎間隙感染最常見的致病菌為葡萄球菌，其中金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌所占比例大致相同[4-6]。萬古霉素通過抑制細菌細胞壁肽聚糖、改變細胞質膜、抑制RNA的合成，從而發揮殺菌作用，常被負載在支架材料上，通過藥物緩釋來實現對疾病的長期治療[7]。Fritzell等[8]研究發現后路胸腰椎融合內固定術中切口內局部使用萬古霉素可明顯減少術后切口感染。

從生物力學角度出發，正常人體腰椎的穩定性由內源性穩定結構和外源性穩定結構來維持，其中椎體、附件、椎間盤及周圍附著韌帶為內源性結構；腰部肌肉調節與控制為外源性結構，任何環節遭受破壞均可引起或誘發腰椎穩定結構失衡[9]。本研究顯示，與模型組比較，萬古霉素250 mg組和萬古霉素500 mg組術后8、12周前屈、后伸、左右側屈、左右旋轉ROM值均減少，術后4、8、12周最大載荷均減少，彈性模量均增加。與萬古霉素125 mg組比較，萬古霉素250 mg組和萬古霉素500 mg組術后8、12周前屈、后伸、左右側屈、左右旋轉ROM值均減少，術后4、8、12周最大載荷均減少，彈性模量均增加。結果表明萬古霉素250 mg組和萬古霉素500 mg組融合效果好，具有較好的生物力學穩定性，這可能與萬古霉素降低植骨部位的炎癥狀態有關。

CT檢查由于靈敏度高、分辨率高，是評價腰椎融合的重要方法之一[10]。本研究通過對CT影像表現與同期病理進行對照觀察，各時間點具有良好的對應關系，因此可以認為CT影像表現的動態變化表現可以直觀地反映自體骨成骨過程中的組織學變化過程，能夠有效評價腰椎融合術后骨移植材料的成骨表現，從而為臨床判定腰椎融合情況提供重要依據。且CT影像學和組織學結果也顯示混合250、500 mg萬古霉素效果優于混合125 mg萬古霉素組及模型組，且混合250、500 mg萬古霉素的CT影像學和組織學無統計學差異。進一步說明混合250、500 mg萬古霉素的髂骨植骨（骨顆粒2 g）后促進了椎體間植入物骨化的進程，提高了融合率。

表3 建模后各組白兔融合段腰椎組織術后8周Micro-CT檢查結果比較

圖2 建模后各組白兔融合段腰椎組織術后8周Micro-CT三維重建圖（a-g：正位；h：側位；i：正位；j：側位）

綜上所述，250、500 mg萬古霉素與髂骨混合促進了椎體間植骨的骨化進程，融合效果好，具有較好的生物力學穩定性，考慮到融合部門血供等因素，最佳混合比例為250 mg萬古霉素與髂骨植骨（骨顆粒2 g）混合。