甲巰咪唑治療Graves病誘發白細胞減少患者Th17/Treg細胞及相關因子的變化及意義*

尚恒，馬金剛，魏紅麗，楊華，范斌，路林峰

（滄州市人民醫院 1.內分泌科，2.體檢中心，3.供應室，4 心內科，河北 滄州 061000）

Graves 病是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，細胞免疫功能的異常在其發病機制中發揮了重要作用[1]。甲巰咪唑是臨床中常用的治療Graves 病的藥物，它除了可抑制甲狀腺激素合成外，還可以快速調節Graves 病患者細胞免疫功能的異常，發揮治療作用[2]。但治療過程中常會誘發白細胞減少，其發生率可達10%左右[3]。那么甲巰咪唑治療Graves 病過程中出現白細胞減少患者與正常白細胞患者在治療前其外周血細胞免疫功能的異常是否存在不同，目前這方面的研究較少。

近年來Treg、Th17 細胞在自身免疫性疾病中的機制研究較多，Th17/Treg 細胞免疫失衡會導致Graves病的發生、發展[4]。本研究擬通過分析甲巰咪唑治療Graves 病過程中出現白細胞減少患者與正常白細胞患者治療前外周血Th17/Treg 及其分泌的細胞因子IL-17、TGF-β 水平，探討細胞免疫功能的變化在甲巰咪唑誘發白細胞減少中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年12月—2018年6月于滄州市人民醫院內分泌科門診或住院的初發Graves 病65 例患者作為研究對象。根據患者的年齡、病情和甲狀腺激素水平，給予甲巰咪唑[0.5～0.7 mg/（kg·d）]治療，并輔以普萘洛爾降低心率，根據甲狀腺功能（以下簡稱甲功）變化的情況，逐漸調整甲巰咪唑治療劑量，以甲巰咪唑治療的前3 個月作為觀察期。選取觀察期內出現白細胞減少癥的Graves 病患者30 例作為白細胞減少組。其中，男性8 例，女性22 例；平均年齡（30.28±6.53）歲；平均病程（7.62±2.93）個月。選取正常白細胞Graves 病患者35 例作為正常白細胞組。其中，男性10 例，女性25 例；平均年齡（33.53±7.64）歲；平均病程（9.12±3.81）個月。選取同期來本院健康體檢者50例作為對照組。其中，男性20例，女性30 例；平均年齡（32.51±6.84）歲。Graves 病診斷依據《中國甲狀腺疾病診治指南》[5]：①高代謝的癥狀和體征；②觸診及B 超檢查彌漫性甲狀腺腫大；③血清總甲狀腺素（total tyroxine 4, TT4）、游離甲狀腺素（free tyroxine 4, FT4）增高，促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）減低；④眼球突出和其他浸潤性眼征；⑤脛前黏液性水腫；⑥促甲狀腺素受體抗體（thyrotropin receptor antibody, TRAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody, TPOAb）陽性。以上①～③項為診斷必備條件，④～⑥項為診斷輔助條件。白細胞減少癥診斷依據：外周血白細胞絕對計數持續＜4.0×109/L 定義為白細胞減少癥，外周血中性粒細胞絕對計數＜2.0×109/L 定義為粒細胞減少癥，＜0.5×109/L 定義為粒細胞缺乏癥。排除標準：①治療前存在白細胞減少、肝功能損害患者；②其他自身免疫性疾以及近期有免疫抑制劑或者皮質類固醇使用者；③亞臨床甲狀腺功能亢進癥（以下簡稱甲亢）、妊娠、近期感染、各種惡性腫瘤及腎功能衰竭患者。由于本研究不探討甲巰咪唑誘發肝損害及其他不良反應的情況，因此需排除甲巰咪唑治療后出現肝功能損害及其他不良反應患者。本研究經滄州市人民醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）的分離空腹抽取研究對象靜脈血5 ml，分離血清用于甲功、甲狀腺自身抗體及細胞因子的檢測。空腹抽取研究對象肝素抗凝靜脈血5 ml，行Ficoll 密度梯度離心法分離PBMC，調整細胞密度為1×106個/ml，懸浮于RPMI 1640 培養液中。

1.2.2 Treg、Th17 細胞的分選Treg 細胞測定：將上述PBMC 與PE-抗人CD4 單克隆抗體（美國eBioscience 公司）、抗人CD25-APC（美國eBioscience公司）進行細胞表面染色，用PE-抗人Foxp3 單克隆抗體進行細胞內因子染色，采用流式細胞分析儀（型號：FACS Calibur，美國BD 公司）檢測。Th17 細胞測定：將PBMC 懸液置于24 孔培養板內，每孔加入佛波酯（美國Alexis 公司）25 ng/ml，伊諾霉素（美國Alexis公司）1μg/ml 后，在37℃孵育箱中培養4 h，收集細胞，加入PE-抗人CD4 單克隆抗體進行細胞表面染色，用PE-抗人IL-17A 單克隆抗體進行細胞內因子染色，采用流式細胞分析儀檢測。用CellQuest 軟件分析數據，以CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T 表示Treg、Th17 細胞百分比。

1.2.3 甲功及甲狀腺自身抗體的測定采用美國羅氏公司的Cobase601 型電化學發光全自動免疫分析系統測定游離三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine,FT3）、FT4及TSH 的水平，采用配套試劑盒。采用美國Beckman Coulter 分析儀通過免疫化學發光法測定甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody, TgAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody,TPO-Ab）及促甲狀腺激素受體抗體（thyrotrophin receptor antibody, TRAb）水平，均采用配套試劑盒。

1.2.4 細胞因子的測定采用ELISA 法檢測細胞因子，采用美國R＆D 公司生產的血清TGF-β、IL-17 ELISA 試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組臨床資料比較

各組年齡、性別及病程比較，差異無統計學意義（P＞0.05），各組甲功、甲狀腺自身抗體水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），正常白細胞組、白細胞減少組FT3、FT4、TgAb、TPO-Ab 及TRAb 較對照組高，TSH 較對照組低，進一步的兩兩比較顯示，白細胞減少組與正常白細胞組FT3、FT4及TPO-Ab 水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），白細胞減少組較正常白細胞組高。見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 各組外周血中Th17、Treg 細胞在CD4+T 細胞中的百分比及Th17/Treg 比較

各組Th17 細胞在CD4+T 細胞中的百分比比較，差異有統計學意義（P＜0.05），正常白細胞組、白細胞減少組均較對照組高（P＜0.05）。各組Treg 細胞在CD4+T 細胞中的百分比比較，差異有統計學意義（P＜0.05），白細胞減少組、正常白細胞組較對照組低（P＜0.05），進一步的兩兩比較顯示，白細胞減少組與正常白細胞組Treg 細胞在CD4+T 細胞中的百分比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組Th17/Treg 比較，差異有統計學意義（P＜0.05），正常白細胞組、白細胞減少組均較對照組高（P＜0.05），進一步的兩兩比較顯示，白細胞減少組與正常白細胞組Th17/Treg比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組外周血中Th17、Treg 細胞在CD4+T 細胞中的百分比及Th17/Treg 比較 （±s）

表2 各組外周血中Th17、Treg 細胞在CD4+T 細胞中的百分比及Th17/Treg 比較 （±s）

組別 n Th17/% Treg/% Th17/Treg白細胞減少組 30 3.36±0.61 3.15±1.11 1.26±0.67正常白細胞組 35 2.88±0.50 3.41±0.94 0.92±0.36對照組 50 1.44±0.32 7.40±2.71 0.23±0.11 F 值 187.201 62.929 69.803 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 各組TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比較

各組TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比較，差異有統計學意義（P＜0.05），白細胞減少組、正常白細胞組IL-17、IL-17/TGF-β 較對照組高（P＜0.05），TGF-β 較對照組低（P＜0.05），進一步的兩兩比較顯示，白細胞減少組與正常白細胞組TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比較 （±s）

表3 各組TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比較 （±s）

IL-17/TGF-β白細胞減少組 30 15.60±2.79 4.50±1.56 3.96±1.81正常白細胞組 35 11.33±2.00 8.30±1.71 1.43±0.42對照組 50 6.62±1.20 15.25±3.33 0.46±0.15 F 值 201.391 186.692 126.876 P 值 0.000 0.000 0.000組別 n IL-17/（pg/ml）TGF-β/（pg/ml）

3 討論

Graves 病的發生、發展是在遺傳易感性和環境因素異常的背景下，導致抑制性T 細胞功能缺陷，輔助性T 細胞定向分化，體液免疫和細胞免疫相互作用，刺激B 細胞產生促甲狀腺受體抗體，從而導致甲亢[6]。Th17、Treg 細胞作為新近研究的T 細胞亞群，在自身免疫性甲狀腺疾病的發生、發展中發揮了重要的作用。Th17 細胞具有很強的致炎功能，其分泌的細胞因子可引起炎癥細胞的浸潤和組織破壞，與炎癥反應的活動性和疾病嚴重程度相關[7]。Treg 細胞具有強大免疫抑制功能，它通過分泌TGF-β 等細胞因子發揮負性免疫調節作用，而特異性轉錄因子Foxp3 在其分化中起著關鍵作用[8]。Th17 與Treg 細胞存在著相互拮抗的作用，Th17/Treg 細胞平衡，可維持機體處于免疫耐受穩態；而在炎癥反應及自身免疫性疾病時，T 細胞的分化受到影響，Treg 細胞分化被抑制，Th17 細胞分化增強，使得Th17/Treg 細胞平衡受到破壞，從而導致機體的損傷[9]。

本研究中發現白細胞減少組及正常白細胞組患者CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞在CD4+T 細胞中的百分比及其分泌的細胞因子TGF-β 的水平較對照組明顯下降，而CD4+IL-17A+Th17 細胞在CD4+T 細胞中的百分比及其分泌的細胞因子IL-17 的水平較對照組明顯升高，提示抑制性T 細胞功能缺陷，輔助性T細胞不適當的致敏參與了Graves 病的發生，這也與BOSSOWSKI 等[4]研究結果一致。

甲巰咪唑是臨床中常使用的抗甲狀腺藥物，白細胞減少是甲巰咪唑治療Graves 病過程中常見的不良反應，其發生率可達10%左右。而多數學者認為甲巰咪唑治療Graves 病出現白細胞減少或缺乏是一個免疫介導的過程，可能與骨髓抑制、存在抗中性粒細胞自身抗體及影響粒細胞某些代謝通道的毒性作用有關[10]。那么Th17/Treg 細胞免疫功能的異常是否對甲巰咪唑誘發白細胞減少的發生產生了影響？本研究比較Treg細胞在白細胞減少組中與正常白細胞組的百分比發現，白細胞減少組雖然有降低的趨勢，但差異無統計學意義。而比較Treg 細胞分泌的細胞因子TGF-β 的水平發現，白細胞減少組較正常白細胞組明顯降低，差異有統計學意義，表明Treg 細胞的數目在白細胞減少組雖然無明顯的降低，但其免疫功能的缺陷在白細胞減少組中更加明顯。比較兩組中Th17 細胞及其分泌的細胞因子IL-17 的水平的差異發現，Th17 細胞的所占百分比以及IL-17 的水平在白細胞減少組中升高更加明顯，差異有統計學意義，提示白細胞減少組中可能存在更加嚴重的炎癥反應。在Th17/Treg 比值方面，白細胞減少組中Th17/Treg 及IL-17/TGF-β 的比值最高，表明Th17/Treg 細胞免疫失衡在白細胞減少組中更加明顯，且向Th17 細胞漂移。由于抑制性T細胞功能明顯降低，致炎細胞功能亢進，推測在白細胞減少組患者中存在更加嚴重的炎癥反應。Th17/Treg細胞免疫失衡向Th17 細胞漂移參與了甲巰咪唑誘發白細胞減少的發生。

甲巰咪唑除了通過抑制甲狀腺內過氧化酶系統，阻斷離子碘生成活性碘過程，減少甲狀腺素、三碘甲狀腺原氨酸合成外，還可以通過調節Graves 病自身免疫紊亂發揮治療作用。COTE-BIGRAS 等[11]提到，經甲巰咪唑治療后可以迅速提高Graves 病患者外周血Treg 細胞的水平，緩慢降低Th17 細胞水平，逐漸糾正Th17/Treg 免疫失衡，且Th17/Treg 免疫平衡穩定的時間與Graves 病復發的時間呈正相關。推測由Th17 細胞所介導的炎癥反應外周血中性粒細胞的動員、募集發揮了重要作用。

綜上所述，因此及時糾正Th17/Treg 細胞免疫失衡向Th17 細胞漂移，能夠減少甲巰咪唑誘發白細胞減少的發生，提高治療Graves 病的安全性。為臨床治療Graves 病提供新的免疫學依據。