自噬在紅景天甙誘導胃癌細胞凋亡中的作用及機制①

榮 黎 李 桓 歐陽凈 王 麗 池祥波 陳耀凱

(重慶市公共衛生醫療救治中心，重慶 400036)

自噬作為Ⅱ型程序性細胞死亡，通過降解自噬成分清除蛋白質異常聚集和受損細胞器調控細胞穩態，與多種疾病發生密切相關[1-3]。在腫瘤發生發展中，細胞自噬呈“兩面性”，在腫瘤藥物治療中發揮不同作用[4-9]。

mTOR(mammalian target of rapamycin)是哺乳動物雷帕霉素的靶點，在腫瘤細胞中表達上調從而抑制自噬，是調控細胞自噬的關鍵節點[10，11]。PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B)作為腫瘤細胞中調控凋亡的經典信號通路，同時也是mTOR的上游靶點，對于后者的激活起重要調控作用[12,13]。

本課題組前期功能實驗已發現紅景天甙不僅能誘導胃癌細胞凋亡，且能誘導自噬[14]。LC3(light chain 3)是自噬發生發展過程中的重要標志性蛋白，其表達水平與自噬水平相對應[15]。本研究聚焦于自噬，探討自噬在紅景天甙促進胃癌細胞凋亡中的作用及機制,為進一步研究紅景天甙在胃癌中的治療作用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人胃癌細胞株AGS由重慶醫科大學基礎醫學院饋贈。

1.1.2試劑與儀器 紅景天苷(南京格爾狄生物科技有限公司)，1640培養基(美國Hyclone),胎牛血清(美國Gibco),IGF-1、氯喹(美國Sigma Aldrich)，Hoechst33342、AV/PI細胞凋亡檢測試劑盒(北京碧云天生物公司)，Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3b及Beclin-1抗體(上海abways technology)，腺病毒載體(上海Hansheng)，流式細胞儀(BD，Intra)，透射電鏡(Philips TECNAI20)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica TCS-SP2)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組 細胞培養于含10%胎牛血清的1640培養基，取對數生長期細胞用于實驗。以不含紅景天甙的1640培養基作為對照組，以40 μmol/L紅景天甙處理的胃癌細胞為實驗組;以10 μmol/L IGF-1和10 μmol/L氯喹(CQ)分別預處理胃癌細胞30 min作為干預組。

1.2.2Hoechst33342細胞核染色 細胞以1×105個/孔接種于含無菌玻片的24孔板，培養24 h，40 μmol/L 紅景天甙(或先經10 μmol/L CQ預處理30 min)處理細胞48 h，PBS洗滌3次，500 μl 4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌3次，以PBS稀釋DAPI(1∶20)，200 μl/孔稀釋液常溫染色10 min，PBS洗滌3次，封片，正置熒光顯微鏡觀察。

1.2.3AV/PI流式細胞術 1×106個/孔AGS細胞接種至6孔板，培養24 h，加入40 μmol/L紅景天甙(或先經10 μmol/L CQ預處理30 min)。48 h后收集細胞，800 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌，懸浮于緩沖液中，Annexin V-FITC和PI室溫暗處染色 15 min，流式細胞儀分析。

1.2.4Western blot 收集處理后的AGS細胞,預冷PBS洗滌1次。100 μl預冷Western細胞裂解液重懸細胞后冰浴裂解30 min,4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清。以牛血清白蛋白(BSA)作為標準品,Lowry法測定樣品蛋白濃度以確定上樣量。樣品經SDS-PAGE電泳后,轉膜、封閉,分別加入一抗和二抗,DAB顯色。室溫輕搖5 min后觀察蛋白條帶,待顯色清晰,轉入PBS中漂洗,ECL化學發光照相。

1.2.5透射電鏡 收集處理后的細胞PBS沖洗2次，2.5%戊二醛室溫固定90 min；1%四氧化鋨固定30 min。梯度脫水后，細胞被包埋、切片，飽和乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色；透射電鏡觀察雙膜自噬囊泡。

1.2.6mRFP-GFP-LC3轉染 收集1×104個處理好的細胞，置于激光共聚焦顯微鏡專用的培養皿中。將10 μl 攜帶mRFP-GFP-LC3腺病毒載體與細胞共培養2 h，換液后繼續培養24 h，利用激光掃描共聚焦顯微鏡拍照觀察熒光自噬斑點的數量與強弱。

2 結果

2.1紅景天甙誘導胃癌細胞自噬體形成 透射電鏡觀察結果表明，與對照組相比，紅景天甙組出現明顯的雙膜自噬囊泡(圖1)，說明紅景天甙成功誘導自噬體的形成。

圖1 透射電鏡觀察紅景天甙誘導胃癌細胞形成雙膜自噬囊泡Fig.1 Formation of double membrane autophagy vesicles in AGS cells induced by salidroside was observed by transmission electron microscope

2.2紅景天甙增加熒光自噬斑點數量和強度 與對照組相比，紅景天甙組胃癌細胞胞漿內熒光自噬斑點數量與強度均明顯上調(圖2)，證明紅景天甙能誘導AGS細胞自噬。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察紅景天甙對熒光自噬斑點的影響Fig.2 Effect of salidroside on number of fluorescence autophagic spots as determined by laser scanning confocal microscopy

2.3氯喹增加紅景天甙誘導的細胞核固縮 Hoechst33342染色結果顯示，紅景天甙處理細胞后細胞核染色質固縮增加，自噬抑制劑氯喹預處理后，紅景天甙誘導的核固縮顯著增加，表明抑制自噬可促進紅景天甙誘導的細胞凋亡(圖3)。

圖3 Hoechst33342染色觀察AGS細胞凋亡形態學變化Fig.3 Morphological changes of AGS cell apoptosis were observed by Hoechst33342 staining

2.4氯喹促進紅景天甙誘導的細胞凋亡 流式細胞分析結果表明，與對照組(4.5±0.7)%相比，紅景天甙組細胞凋亡率(13.7±0.9)%明顯提高，自噬抑制劑氯喹預處理后，紅景天甙的促凋亡效應顯著增強(圖4)，凋亡率由(13.7±0.9)%上升為(25.2±1.2)%。表明抑制自噬可增強紅景天甙的促凋亡作用。

圖4 流式細胞檢測胃癌細胞凋亡數量Fig.4 Apoptosis number of gastric cancer cells was detected by flow cytometry

2.5氯喹紅景天甙對凋亡相關蛋白的表達影響 與對照組相比，紅景天甙下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，上調促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase9表達。自噬抑制劑氯喹預處理后，紅景天甙誘導的促凋亡蛋白表達上調(圖5)。

圖5 Western blot檢測氯喹預處理對凋亡相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of chloroquine on apoptosis-related protein expressions was detected by Western blot

2.6紅景天甙通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路誘導胃癌細胞自噬 紅景天甙明顯抑制PI3K、AKT和mTOR活化，磷酸化PI3K蛋白、磷酸化AKT蛋白和磷酸化mTOR蛋白表達下調(圖6)。PI3K/AKT激動劑IGF-1干預處理后，自噬關鍵蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1表達降低(圖7),熒光自噬斑點的數量和強度明顯減弱(圖8)。表明激活mTOR上游調節通路PI3K/AKT可抑制自噬蛋白表達。

圖6 Western blot檢測紅景天甙對PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的影響Fig.6 Effect of salidroside on PI3K/AKT/mTOR pathway proteins was detected by Western blot

圖7 Western blot檢測IGF-1對自噬蛋白表達的影響Fig.7 Effect of IGF-1 on autophagy proteins expressions was detected by Western blot

圖8 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察IGF-1預處理對熒光自噬斑點表達的影響Fig.8 Effect of IGF-1 on expression of fluorescent autophagy spots was observed by laser scanning confocal microscope

3 討論

自噬是Ashford和Porter在1962年發現細胞內“自己吃自己”現象后提出的概念，是必需的溶酶體降解過程，通過清除蛋白質聚集物和受損細胞器控制細胞質量[1]。自噬形成的雙膜自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，進而降低自噬成分，滿足細胞本身代謝需要和實現部分細胞器更新[2]。自噬對機體自我平衡具有重要調節作用，其降解作用與多種疾病密切相關，包括代謝失調、神經病變、癌癥及感染性疾病等[3]。

自噬有利于維持細胞穩態，應激條件下，自噬可防止有毒或致癌的蛋白質和細胞器累積，防止細胞癌變。而腫瘤一旦形成，自噬則為癌細胞提供更豐富的營養，促進腫瘤生長[16]。因此，在腫瘤發生發展過程中，細胞自噬的作用呈現完全相反的“兩面性”[17]。各種病理狀態下，自噬的作用到底是正向還是負向尚未完全闡明，尤其是腫瘤研究。研究表明，自噬在不同藥物治療腫瘤中發揮不同作用，可能增強藥物療效，也可能抑制藥物對腫瘤細胞的殺傷作用[6-9,18]。因此，自噬作為調控腫瘤細胞生長的重要機制值得重點關注。

mTOR在腫瘤細胞中通常表達上調從而抑制細胞自噬[10]。作為細胞自噬中眾多信號傳導通路的關鍵節點和最主要的抑制性通路，具有重要作用[11]。PI3K/AKT作為腫瘤細胞中調控凋亡的經典信號通路，同時也是mTOR的上游靶點，前者對于后者的激活起重要作用[12,13]。因此，腫瘤細胞中自噬和凋亡關系密切。闡明紅景天甙誘導的自噬現象在其抑制胃癌細胞增殖、促進凋亡等眾多細胞表型中的作用及機制，將為胃癌防治新藥物開發提供參考。

本研究主要聚焦于自噬，探討自噬在紅景天甙促進胃癌細胞凋亡中的作用及相關機制。通過透射電鏡和mRFP-GFP-LC3轉染證實紅景天甙誘導AGS細胞自噬，利用經典的自噬晚期抑制劑氯喹預處理細胞[19]。通過Hoechst染色、流式細胞術和Western blot多角度提示抑制自噬可明顯促進紅景天甙誘導的細胞凋亡，表明自噬是細胞在外界攻擊因素作用下激發的自我保護性防御反射,與Wang等[9]研究結論相似。提示在后續研究中，可進一步聯合應用紅景天甙和自噬抑制劑協同殺傷胃癌細胞。為進一步闡明紅景天甙誘導AGS細胞自噬的機制，課題組通過Western blot實驗發現紅景天甙抑制磷酸化PI3K、磷酸化AKT以及磷酸化mTOR蛋白表達，利用IGF-1預處理細胞，通過Western blot和熒光共聚焦顯微鏡觀察發現，激活mTOR的上游調節通路PI3K/AKT可降低自噬蛋白表達，提示紅景天甙可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導人胃癌AGS細胞自噬，與Fan等[20]結論一致。

紅景天甙作為植物類中藥在腫瘤防治中具有諸多優勢，腫瘤研究初步顯示出其特有的抗癌效果，具備研究潛力。課題組后續將利用細胞、動物模型結合基因、蛋白組學并聯合生物信息學技術等手段對紅景天甙的抗癌作用進行深入研究，為闡明紅景天甙防治腫瘤的機制奠定重要基礎。