原發性肝細胞癌中Ezrin和Survivin的表達及其與淋巴結轉移的關系*

韋花媚，陸海善，韋仕喜，黎俊楠，黃群芳

（右江民族醫學院附屬醫院 病理科，廣西 百色 533000）

原發性肝細胞癌為一種常見的消化系統惡性腫瘤，在發達國家中的病死率居各類惡性腫瘤的前列[1]。隨著對肝癌發病機制的深入研究，發現肝癌細胞淋巴結轉移是造成患者死亡的主要原因之一，因此，研究與肝癌細胞淋巴結轉移相關基因蛋白表達變化可為肝癌的診療提供可靠的生物標志物[2]。Ezrin 屬ERM（ezrin,radixin,moesin）成員，為膜細胞骨架連接蛋白，不僅在細胞的運動、遷移、黏附、有絲分裂等生理功能中起關鍵作用，還參與多種惡性腫瘤的淋巴結轉移[3]。研究表明[4]，Ezrin 主要通過調節信號傳導和黏附分子的途徑參與細胞與基質、細胞與細胞之間的相互作用。Survivin 屬凋亡抑制因子家族，在抗凋亡機制中發揮重要作用，特異性表達于細胞的G2/M 期，且僅在腫瘤惡性轉化的早期表達，可有效促進部分損傷惡性轉化，但其具體的活化機制尚未闡明[5]。本研究通過檢測原發性肝細胞癌前病變組織和原發性肝細胞癌組織Ezrin 和Survivin 的表達水平，探討二者與原發性肝細胞癌浸潤和淋巴結轉移的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月—2018年5月右江民族醫學院附屬醫院接受手術切除的98 例原發性肝細胞癌患者的癌組織標本。其中，男性68 例，女性30 例；年齡46～85 歲，平均（67.52±6.48）歲；病程1～7年，平均（4.21±3.75）年。98 例患者中，淋巴結轉移58例（有淋巴結轉移組），無淋巴結轉移40 例（無淋巴結轉移組）。9 例肝組織正常標本采自正常肝組織（正常對照組）。按Edmondson 法[6]進行分級，根據腫瘤形態和分化程度分為Ⅰ～Ⅳ級，其中Ⅰ級10 例，均無淋巴結轉移；Ⅱ級36 例，其中，20 例有淋巴結轉移，16 例無淋巴結轉移；Ⅲ級38 例，其中，24 例有淋巴結轉移，14 例無淋巴結轉移；Ⅳ級14 例，均有淋巴結轉移。以上標本均經病理檢查核實。

1.2 主要試劑

Ezrin 鼠抗人單克隆抗體購自武漢博士德公司，Survivin 兔抗人單克隆抗體購自福州邁新公司。

1.3 操作方法

所有標本用10%甲醛固定后常規石蠟包埋，4 μm連續切片，最后進行蘇木精-伊紅（HE）染色、SP 免疫組織化學染色及光學顯微鏡觀察。根據SP 試劑盒說明書步驟進行操作，一抗濃度為1 ∶500，分別與陽性對照比較。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）替代一抗作陰性對照。

1.4 結果判定

分別用高倍鏡和低倍鏡觀察切片，細胞膜或細胞質內出現棕黃色顆粒為Ezrin 及Survivin 蛋白陽性表達。每個切片隨機選擇5 個高倍視野觀察，根據染色強度和陽性細胞數所占百分比計分。染色強度：無色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分；陽性細胞數：≤5%計0 分，＞5%～25%計1 分，＞25%～50%計2 分，＞50%計3 分。最后計算染色強度與陽性細胞數得分的乘積，0 分為（-），1、2、3 分為弱陽性（+），4、5 分為中度陽性（++），6 分為強陽性（+++）。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件，計數資料以率（%）表示，3 組資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原發性肝細胞癌組織與正常肝組織中Ezrin表達的比較

Ezrin 陽性表達于細胞質或細胞膜上，在原發性肝細胞癌組織中呈片狀彌散分布，主要為弱陽性至中度陽性表達（見圖1）。正常對照組、無淋巴結轉移組與有淋巴結轉移組Ezrin 陽性表達率分別為33.3%、42.5%和69.0%，3 組比較差異有統計學意義（χ2=8.795，P=0.012）；有淋巴結轉移組Ezrin 的陽性表達水平高于無淋巴結轉移組（χ2=6.814，P=0.009）；無淋巴結轉移組Ezrin 陽性表達水平與正常對照組比較，差異無統計學意義（χ2=0.256，P=0.613）。見表1。

圖1 正常肝組織和原發性肝細胞癌組織中Ezrin 蛋白的表達 （SP ×200）

表1 3 組Ezrin 陽性表達率的比較

2.2 原發性肝細胞癌組織與正常肝組織中Survivin 表達的比較

Survivin 陽性表達于細胞質，在原發性肝細胞癌組織中呈片狀彌散分布，主要為中至強陽性表達（見圖2）。正常對照組、無淋巴結轉移組與有淋巴結轉移組Survivin 陽性表達率分別為0.0%、50.0%和84.5%，3 組比較差異有統計學意義（χ2=30.134，P=0.000）；有淋巴結轉移組Survivin 的陽性表達水平高于正常對照組和無淋巴結轉移組（χ2=28.302 和13.510，均P=0.000）；無淋巴結轉移組Survivin 陽性表達水平高于正常對照組（χ2=7.603，P=0.006）。見表2。

圖2 正常肝組織和原發性肝細胞癌組織中Survivin蛋白的表達 （SP ×200）

表2 3 組Survivin 陽性表達率的比較

2.3 Ezrin、Survivin 表達與原發性肝細胞癌臨床分級的關系

Ⅰ～Ⅳ級的原發性肝細胞癌Ezrin 與Survivin 的表達差異無統計學意義（P＞0.05），提示Ezrin 與Survivin表達與原發性肝細胞癌的臨床分級無關。見表3。

2.4 Ezrin、Survivin 表達的相關性

Spearman 相關性分析顯示，有淋巴結轉移的肝細胞癌組織中，Ezrin 與Survivin 的表達呈正相關（rs=0.458和0.489，均P=0.000）。

表3 不同臨床分級Ezrin 和Survivin 陽性表達的比較 例

3 討論

通過加強對肝癌分子病理機制的研究，找出與肝癌發生、發展、復發與淋巴結轉移相關的關鍵調控因素具有十分重要的臨床意義。越來越多的研究表明[7]，細胞骨架連接蛋白Ezrin 和細胞黏附分子是影響細胞黏附功能和腫瘤細胞惡性進展的重要物質。Ezrin 在腫瘤發展、浸潤和淋巴結轉移進程中發揮關鍵作用[8-9]。有文獻報道[10]，Ezrin的表達決定惡性腫瘤的吞噬功能，而吞噬功能則與惡性腫瘤淋巴結轉移密切相關。本研究發現，有淋巴結轉移組Ezrin 的表達水平高于無淋巴結轉移組，說明Ezrin 與腫瘤的進展過程關系密切，其表達隨著惡性程度的增加呈上升趨勢。

Surivivin 蛋白是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，Survivin 具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織中，且與腫瘤的分化增殖、浸潤程度、淋巴結轉移存在密切關聯[11]。Survivin 屬凋亡抑制因子家族，定位于17q25 染色體，編碼143 個氨基酸；其獨特之處在于僅有一個氨基酸Zn2+結合的BIR 區，由一個卷曲螺旋結構代替缺乏縮氨酸的指環結構，而該結構與Survivin 的抗凋亡機制關系密切[12]。研究表明[13]，正常成人組織除了胎盤和胸腺，其他組織的Survivin 含量較低，而在腫瘤細胞中Survivin mRNA 和蛋白呈高表達狀態。結腸息肉、鮑恩病、乳腺腺瘤等癌前病變中也出現Survivin 的表達，提示Survivin 可出現于腫瘤惡性轉化的早期，并參與惡性損傷轉化的整個進程，但具體的參與方式尚不清楚。本研究中，有淋巴結轉移組Survivin 的表達水平高于正常對照組和無淋巴結轉移組；無淋巴結轉移組Survivin 表達水平高于正常對照組，說明Survivin 與腫瘤的進展過程關系密切，其表達隨著惡性程度的增加呈上升趨勢，與文獻研究結果相符[14]。另外，本文發現Survivin 蛋白在原發性肝細胞癌組織中呈過量表達的形式，推測Survivin 的異常表達可能發生于原發性肝細胞癌的早期階段。分析其原因可能為原發性肝細胞癌早期階段通過抑制細胞凋亡，而一些存在缺陷的基因細胞會繼續不停地生長，從而促進基因突變的聚集，進而使細胞發生惡性轉化，誘導原發性肝細胞癌的發生。分析Survivin 蛋白的表達與臨床病理的相關性，結果發現Survivin 與淋巴結轉移存在密切關聯，隨淋巴結轉移，Survivin 蛋白水平呈高表達，高表達的Survinvin 參與腫瘤細胞的生長及淋巴結轉移。

原發性肝細胞癌轉移的主要途徑是淋巴結轉移，可在早期出現，是原發性肝細胞癌判斷預后的重要因素之一。本研究中，原發性肝細胞癌Ⅰ～Ⅳ級患者Survivin 的表達水平無差異，說明Survivin 的表達水平與臨床分級無關。而淋巴結轉移組的Survivin 的表達水平高于無淋巴結轉移組，提示Survivin 的表達與淋巴結轉移關系密切。

綜上所述，Ezrin 與Survivin 在原發性肝細胞癌中的高表達與原發性肝細胞癌的侵襲性行為關系密切，可作為評估早期原發性肝細胞癌預后的指標之一。