γ-聚谷氨酸的研究進展

何宇 呂衛光 張娟琴

摘要 γ-聚谷氨酸是一種綠色環保型高分子聚合材料，具有良好的吸附性、保水性和生物相容性，可以被生物體完全降解，作為生物絮凝劑、肥料增效劑、保濕劑、藥物載體、食品添加劑等應用于農業生產、醫藥、化妝品、環保和食品等眾多領域，引起了國內外學者的廣泛關注。對γ-聚谷氨酸的結構性質、制備方法、提取和應用方面進行綜述，重點論述了微生物發酵法生產γ-聚谷氨酸和γ-聚谷氨酸的應用;最后，基于γ-聚谷氨酸的研究進展和應用，對γ-聚谷氨酸制備中現存問題和未來發展方向進行展望。

關鍵詞 γ-聚谷氨酸;微生物發酵法;結構性質;制備方法;提取;應用

中圖分類號 TQ317 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）18-0018-05

Abstract γpolyglutamic acid is a kind of environmental friendly polymer material，which has good adsorption，water retention and biocompatibility，and can be completely degraded by organisms.As bioflocculant，fertilizer synergist，humectant，drug carrier and food additive，γpolyglutamic acid has been widely used in many fields such as agricultural production，medicine，cosmetics，environmental protection and food.The structural properties，preparation methods，extraction and application of γpolyglutamic acid were reviewed，and the application of γpolyglutamic acid produced by microbial fermentation and γpolyglutamic acid was mainly discussed.Finally，based on the research progress and application of γpolyglutamic acid，the existing problems and future development direction in the preparation of γpolyglutamic acid were prospected.

Key words γpolyglutamic acid;Microbial fermentation method;Structural properties;Preparation methods;Extraction;Application

聚谷氨酸（polyglutamic acid，PGA）由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過酰胺鍵聚合而成。由于聚合方式不同，聚谷氨酸主要有2種構型：通過α-酰胺鍵聚合的α-聚谷氨酸（α-PGA）和通過γ-酰胺鍵聚合的γ-聚谷氨酸（γ-PGA），分子量在10～10 000 kDa。其中，α-PGA多以化學途徑合成，而γ-PGA多以生物途徑合成。

γ-PGA，也稱多聚谷氨酸，是一種陰離子型多肽聚合物。γ-聚谷氨酸最早在1937年由Ivanovic等[1]在炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）的莢膜中發現，屬芽孢桿菌莢膜的主要成分[1];1942年，Bovarnick從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的發酵液中提取到γ-PGA;之后，Nagai等[2]又在納豆桿菌（Bacillus natto）中發現γ-PGA的存在。γ-PGA具有高分子量、易分散和無毒無害可食用等優良特性，是一種新型綠色高分子材料，被廣泛應用于農業生產、食品、醫藥等眾多領域。因此，筆者對γ-PGA的基本特性、生產制備及應用等方面進行綜述，以期為γ-PGA的進一步工業化應用提供借鑒。

1 γ-PGA的結構與性質

γ-PGA是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過γ-酰胺鍵聚合而成的多聚氨基酸，大多由500～5 000個谷氨酸單體組成[3]。γ-PGA相對分子量會隨著處理方式和發酵環境的不同而不同，如隨著發酵環境的酸化和溫度的升高，生成的γ-PGA分子量會逐漸下降[4]。另外，在不同pH發酵環境中，γ-PGA分子表現出不同的構型，例如在酸性環境下γ-PGA呈螺旋狀結構，在中性環境下γ-PGA呈樹枝狀鏈結構，在堿性環境下γ-PGA呈舒展狀結構[5]。游離型γ-PGA的酸度系數（pKa）為2.23，熔點為223.5 ℃，玻璃化溫度為54.82 ℃，熱分解溫度為235.9 ℃，γ-PGA鈉鹽的旋光度為-70°[6]。由于有大量游離親水性羧基和氫鍵的存在，使得γ-PGA具有極強的保水性、抗逆性和超強的離子吸附性。通過觀察X射線衍射譜圖，發現了γ-PGA分子中羧基的空間位阻和分子間氫鍵的雙重作用會導致分子鏈無法保證規整，阻礙γ-PGA結晶，表現出無定形態。另外，在生物分解作用影響下，γ-PGA中的肽鍵會發生斷裂，使γ-PGA直鏈分子被降解為單體、小分子或是短肽[7]，因此γ-PGA還具有極好的可生物降解性。

2 γ-PGA的制備方法

隨著研究的不斷深入，化學合成法、提取法、酶轉化法和微生物發酵法等生產技術被廣泛地應用于γ-PGA的制備。在制備γ-PGA的過程中，微生物發酵法是γ-PGA生產和研究的熱點和重點。

2.1 化學合成法

化學合成法包括二聚體縮聚法和傳統多肽合成法。二聚體縮聚法制備γ-PGA分為3個部分，首先由D-谷氨酸和L-谷氨酸反應生成α-甲基谷氨酸，之后由α-甲基谷氨酸經凝聚反應生成聚谷氨酸甲基酯，最后經過堿性水解得到γ-PGA[8]。γ-PGA屬于多肽聚合物，因此可使用多肽合成法將氨基酸逐個連接形成多肽。多肽合成法較為傳統，合成需要進行基團保護、活化、氧化偶聯和羧基脫保護等過程，合成工藝繁瑣、成本高、得率低，且伴有大量副產物的產出，尤其不適用于制備20個氨基酸以上的大分子物質[9]。

2.2 提取法

納豆是一種通過枯草芽孢桿菌發酵而成的豆制食物，具有一定的黏性，其納豆黏性膠體的主要組成成分就是γ-PGA。提取γ-PGA時，首先將納豆煮熟，然后浸泡在去離子水中，待γ-PGA完全溶于水中，再將水中的γ-PGA用有機溶劑提取出來。因此，早期獲取γ-PGA大多是在發酵食物納豆中利用有機溶劑進行提取。提取法雖然簡便易操作，但利用該方法所分離出的γ-PGA為粗產品[10]，雜質多、成本較高且難以大規模進行生產，應用價值較低。

2.3 酶轉化法

酶轉化法可以有效地克服多肽合成法和提取法的缺點。酶轉換法利用一步酶促反應，將谷氨酸單體連接成γ-PGA高分子，高效避免了復雜反應中的反饋和負反饋調節作用，積累得到高濃度的γ-PGA[11]。在這個過程中，谷氨酸轉肽酶（GTP）作為關鍵性酶[12]，將谷氨酸基催化后移至受體，然后進行自動轉肽。該方法反應溫和、產物雜質少、純度高，有利于后續的γ-PGA分離純化。但使用酶轉化法得到的γ-PGA聚合度低且分子量小，而γ-PGA分子量的大小直接關系到γ-PGA的物理性質、化學性質及應用[13]，因此該方法的應用價值同樣有待提高。

2.4 微生物發酵法

目前，微生物發酵法是工業生產中普遍采用的最佳γ-PGA制備方法，通過菌種篩選、菌體培養和分離純化制得分子量適宜的γ-PGA。該方法條件溫和、工藝簡單，可進行大規模生產。發酵法可分為液體發酵法、固體發酵法和分批發酵法等，發酵過程中主要使用的合成菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）等芽孢桿菌屬。

工業上生產γ-PGA多使用液體發酵法，使用液體發酵法易于通過調控發酵過程中的可控因素進而調節產物分子量，最終得到目標分子量產物，有效提高工業產率[14]，可控因素包括pH、環境溫度、培養基離子強度、接種量等。趙曉行[9]以解淀粉芽孢桿菌YP-2為對象，選擇不同初始發酵pH和發酵溫度，結果表明初始pH在7.0～7.5時具有最高γ-PGA產量（25.24 g/L），發酵溫度在37 ℃時達到最高產量（38.39 g/L）。

固體發酵法因使用固體發酵物（如農業、工業產生的廢棄物）作為發酵底物而得名，例如牛糞堆肥、味精和食醋生產產生的殘留廢物都已被研究應用制備γ-PGA，通過該方法既可獲得目標產物，又提高了資源利用率。張彥麗[15]培養枯草芽孢桿菌168產γ-PGA，通過響應面法優化發酵工藝，50 mL味精廢水接種量為10.55 mL，γ-PGA產量達到（53.51±0.92）g/L。韓文靜等[16]利用味精副產品發酵產γ-PGA，通過產酸率高低調控最優發酵條件，pH為7.0，發酵溫度32 ℃，γ-PGA產量最高達到57.8 g/L，實現副產物再利用并降低了生產成本。

另外，分批發酵法也被廣泛使用于γ-PGA制備，通過分批式加入部分培養基營養成分，同時也分批次取出發酵液并進行分離提純γ-PGA，有效避免γ-PGA蓄積導致的底物負反饋抑制效應，提高產率。目前，對于微生物發酵法產γ-PGA的研究集中致力于篩選具有優良性狀的菌株，之后將外源基因整合入γ-PGA菌株基因組中，以此提高γ-PGA產量[17]。

3 γ-PGA的生物合成

3.1 γ-PGA生產菌株

γ-PGA的生產菌種根據是否需要在發酵過程中大量添加谷氨酸單體被分為谷氨酸依賴型（Ⅰ型）和非谷氨酸依賴型（Ⅱ型）兩大類[18]。非谷氨酸依賴型菌株的產量相比谷氨酸依賴型菌株要低得多，因此我國主要針對谷氨酸依賴型菌株產γ-PGA進行研究。現已鑒定出的γ-PGA生產菌株包括芽孢桿菌、梭桿菌、古細菌及真核生物[19]。其中，在芽孢桿菌的莢膜中，γ-PGA屬主要成分，且菌體本身具有合成γ-PGA的效應機制，因此芽孢桿菌較其他生產菌株具有天然優勢，是目前制備γ-PGA最常用的菌株。可制備γ-PGA的芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）、地衣芽孢桿菌（B.an mLoliquefaciens）、耐熱芽孢桿菌（B.thermotolerant）和解淀粉芽孢桿菌（B.an mLoliquefaciens）[20]。

3.2 產γ-PGA菌株選育

由于天然存在的產γ-PGA菌種產量較低，因此需要對高產菌株進行定向篩選，多通過誘變法或基因工程法等方法，以此達到穩定高產的效果。誘變法主要借助物理因子和化學誘變劑完成，物理因子包括紫外線、γ射線、激光等，化學誘變劑包括亞硝基胍、硫酸二乙酯、秋水仙素等，經過處理后的某些菌株會由于基因的片段缺失或轉移導致基因突變，從而強化或減弱生物的某種特性，達到對特定目標菌株選育的目的。張瑞等[21]通過紫外線-亞硝基胍復合誘變法選育出一株產γ-PGA突變菌株，在多次傳代后可保持穩定遺傳，γ-PGA產量由18.4 g/L提高至24.2 g/L。

此外，有學者利用基因工程手段將γ-PGA基因片段導入其他菌株中，使目標菌株具有合成γ-PGA相關基因簇，基因重組得到產γ-PGA的菌株。發生基因重組后的菌種生命力會更強，抗逆性也會相應增強，產γ-PGA的周期大大縮短，具有多種優勢，但由于基因供體菌和受體菌的合成機能存在差異，可能導致基因不能正常表達[22]，因此利用該方法發酵生產γ-PGA的產量極其不穩定，不能大規模應用于生產中。

3.3 γ-PGA合成途徑

γ-PGA合成機制一直是研究的熱點，分子生物學和代謝工程學等理論都被應用在γ-PGA生物合成的研究中。合成菌株不同，對谷氨酸底物的需求也不同，γ-PGA的代謝機制和合成酶也有所差異。Bacillus subtilis IFO 3335菌株是典型的谷氨酸依賴型菌株，僅需少量外源谷氨酸作為合成活化劑，而培養基中的檸檬酸和硫酸銨經過菌株自身代謝才是合成γ-PGA所需單體谷氨酸的主要來源。

Goto等[23]研究發現Bacillus subtilis IFO 3335菌株通過α-酮戊二酸的2種途徑合成L型谷氨酸，再通過γ-PGA合成酶合成γ-PGA，在這一過程中，谷氨酸單體是菌株經自身代謝而生成的。另外，在Bacillus subtilis IFO 3335菌株中檢查到高活性谷氨酸消旋酶，是γ-PGA合成過程中的主要酶[24]。Cromwick等[25]通過核磁共振技術研究Bacillus licheniformis ATCC 9945A菌株產γ-PGA途徑，利用13C標記谷氨酸和檸檬酸，發現在培養基中產生極少量的γ-PGA，而在培養基中添加外源L-谷氨酸和13C標記的檸檬酸后，培養基中產生大量標記γ-PGA，這表明在Bacillus licheniformis ATCC 9945A菌株產γ-PGA過程中的谷氨酸單體并不是通過碳源分解和三羧酸循環等環節產生的。

γ-PGA的合成酶基因根據γ-PGA合成后的狀態進行命名。當合成的γ-PGA與細菌細胞壁結合形成莢膜，該γ-PGA合成酶基因命名為cap（capsule）基因，當合成的γ-PGA釋放到胞外，該γ-PGA合成酶基因命名為pgs（polyglutamate synthase）基因[26]。在Bacillus subtilis IFO 3336中存在3個γ-PGA合成酶基因（pgsA、pgsB和pgsC），其中，pgsA將pgsBCA同源復合體定于細胞膜上，pgsB為酰胺連接酶，參與催化和聚合反應，pgsC與乙酰轉移酶結構相似，參與γ-PGA的轉運[27]。

4 γ-PGA的提取

隨著研究的深入，γ-PGA的提取方法越來越多，例如膜分離沉淀法、有機溶劑沉淀法、化學沉淀法、分級沉淀法和硅藻土沉淀法等，而前3種提取技術相對成熟。

由于γ-PGA分子量最高可達200萬kDa，因此在制備過程中隨著γ-PGA的積累，培養液黏度變大，影響發酵效果和產量。針對這種情況，Do等[28]使用膜分離沉淀法，既可從高黏度培養液中有效提取γ-PGA，又大大節省試劑的使用。首先通過沉淀從培養液中分離出粗γ-PGA，之后使用超濾濃縮方法利用中空纖維膜獲得濃縮液，在這個過程中將培養液pH逐漸調至3并酸化，以此達到降低培養液黏度的目的。酸化處理后的γ-PGA能量消耗降低17%，乙醇的用量降低75%。

有機溶劑沉淀法通常先將發酵液進行離心處理，在上清液中加入低級醇類，例如甲醇、乙醇，加入體積一般為發酵液的2～4倍，過夜沉淀后離心收集沉淀物，最后進行沉淀物冷凍干燥獲得γ-PGA粗產品，之后進行透析脫鹽去除雜質獲得純品[29]。

化學沉淀法與有機溶劑沉淀法的區別在于將上清液中加入的低級醇類用氯化鈉溶液或飽和硫酸銅代替，沉淀物水洗后加入HCl溶液二次沉淀，之后加入蒸餾水溶解γ-PGA，溶解后上清液中加HS，最后進行沉淀和沉淀物冷凍干燥獲得γ-PGA。

5 γ-PGA的應用

γ-PGA作為一種新型的多功能生物制品，具有無毒無害、可食用、易降解和保水性等特性，在農業生產、醫藥和食品等多個領域都有較強的應用空間。γ-PGA的性質與其分子量密切相關，因此不同分子量γ-PGA的應用領域不同，根據γ-PGA不同應用領域所需分子量的大小，可將γ-PGA分為4個類別，即農業類、食品類、化妝品類和醫藥類，其中前兩類所需分子量較低，均小于70萬單位，農業類可低至0.5～1.0萬單位，后兩類所需分子量相對較高，均大于70萬單位，例如醫藥類需要PGA分子量達120～200萬單位[30]。

5.1 γ-PGA在農業領域的應用

5.1.1 保水保濕劑。

在我國西北地區，水資源稀缺導致不同程度的干旱災害出現，也使得植被和作物生長受限，影響我國的農業發展。保水劑對干旱地區植被具有很好的生長效益，是一種具有極強吸水力和保水力的高分子聚合物，可減少土壤中水分的蒸發，同時緩慢釋放水分供植物生長利用[31]。利用電子射線對γ-PGA進行數秒照射后，可以形成一種具有高吸水性能的樹脂，從而吸收大量水分。日本學者在水資源匱乏的阿蘇山利用γ-PGA進行生態綠化試驗，他們使用γ-PGA吸水樹脂進行種子包埋試驗，將包埋種子撒于寸草不生的沙地，結果表明經過處理的種子在7 d后發芽并順利生長[32]。

5.1.2 促進種子萌發。種子萌發過程中，脂質過氧化會大大降低種子活力，影響萌發狀態，只有消除活性氧引起的過氧化損害，提高過氧化物酶的活性，才能保證種子正常萌發。在不同分子量大小的γ-PGA中置入綠豆種子，記錄種子的發芽勢和發芽率，結果表明，高分子量γ-PGA抑制種子萌發，低分子量γ-PGA促進種子萌發，但二者的結果均比空白對照組數值高[33]。王建平等[34]用不同濃度γ-PGA溶液進行浸種處理，發現煙草種子的芽長、發芽系數和活力指數等都有明顯的提高，其中發芽系數最高提升28%，活力指數較對照提高18.8%，同時種子發芽后過氧化物酶活性增幅達到67.32%，說明γ-PGA浸種能夠提高種子萌發活力。

5.1.3 肥料增效劑。

γ-聚谷氨酸作為肥料增效劑被廣泛地應用于農業生產中。目前的研究形式多為無機肥料與γ-PGA混合使用，而直接施用γ-PGA菌肥以改善土壤環境，也可取得肥料增效效果。王進[35]將枯草芽孢桿菌發酵產物直接作為菌肥施用，試驗結果表明，添加菌肥與不添加菌肥相比，植株生長明顯，產量高30.4%，株高和莖粗也明顯優于后者，既促進了植物生長又達到了肥料減量的效果。γ-PGA顯著提高植物對氮、磷和鉀的吸收，增強植物對養分的吸收[36]。Bai等[37]研究發現PGA施用量對作物增產及肥料利用率提高亦有顯著影響。

5.2 γ-PGA在醫藥領域的應用

5.2.1 藥物載體。

γ-PGA主鏈上含有大量活性較高的游離羧基，可同某些分子結合形成穩定化合物[33]。γ-PGA屬于典型的聚電解質，與其他聚電解質相比，γ-PGA具有良好的生物降解性，可自行降解為單體，具有無毒副作用。許多天然藥物具有難溶性和不穩定性，使生物對藥物的利用率大大降低。因此，研究人員利用γ-PGA及其衍生物的高活性羧基與藥物或其中有效成分的結合，解決天然藥物難溶于水或不穩定的問題[38]，尤其是對人體細胞有傷害作用的化療藥物，既提高藥效活性，同時也減輕藥物毒副作用。

5.2.2 組織工程支架。

γ-PGA良好的生物相容性被應用于組織工程支架的制備。疏秀林等[39]采用接枝共聚法將γ-PGA與殼聚糖制備成γ-PGA/CMCS多孔復合材料，該材料吸水性強，有較高的攜藥能力，將其與碳酸鈣骨水泥進行復合，可有效縮短碳酸鈣骨水泥的凝固時間，促進骨骼的生長和愈合，是一種新型植骨生物材料[40]。

5.3 γ-PGA在環保領域的應用

在污水處理過程中，常常使用絮凝沉淀法以達到高效的污水處理效果。絮凝劑種類繁多，其品質直接影響著處理效果。γ-PGA屬線型同聚酰胺高分子，具有優良的黏結性、吸水性和吸附架橋作用，在水污染處理中可作為環境友好型絮凝劑使用，具有廣闊的應用前景[41]。李曼[42]篩選獲得菌株Bacillus sp.DLF-15161發酵生產絮凝劑γ-PGA，通過優化試驗得到最佳γ-PGA用量和最佳絮凝介質高嶺土，可對水體中Cr6+、Cu2+吸附，并達到國家水質排放標準。Bajaj等[43]對γ-PGA絮凝活性進行研究，優化了Bacillus subtilis R23發酵生產的γ-PGA的絮凝條件、最佳絮凝pH和最佳助凝離子，結果顯示最終的絮凝活性最大可達34.7l/OD。

染料行業排放的廢水中含有大量有毒有害成分，其中還包括具有強致癌性的原料副產物，若未進行有效的脫色凈化處理，會對水資源和人類身體造成嚴重危害。婁春霞[20]從污泥中篩選出γ-PGA菌株，通過響應面法得到最優培養基，最佳絮凝時間為3 min，最優條件下絮凝率達94.7%，對染料廢液的凈化脫色率達64.5%，實現了廢水絮凝和脫色同步進行。對廢水中染料的處理包括物理方法、化學方法和生物脫色方法，利用γ-PGA對亞甲基藍染料進行生物脫色處理，飽和吸附容量為496 mg/g[44]。

5.4 γ-PGA在化妝品領域的應用

γ-PGA良好的保水性和吸水性同樣運用在化妝品制造業中，目前已有化妝品將γ-PGA作為原料加以使用，不僅具有美白功效，而且還可保持肌膚水分，加速組織再生。低分子量γ-PGA可被皮膚吸收并達到深度保濕效果，高分子量γ-PGA可在皮膚表面形成膜結構，有利于保護皮膚水分，具有鎖水保濕效果[45]。何貴東[46]通過有機-無機雜化技術制備具有良好生物相容性的納米Ag/γ-PGA水凝膠，在Balb/c小鼠動物皮膚上做去除創傷模型，結果發現，該水凝膠具有長效的抑菌效果，炎癥反應有明顯的好轉，在使用水凝膠后14 d可完全恢復。陳毓曦等[47]對不同相對濕度和不同濃度γ-PGA保濕性進行測定分析，表征結果顯示γ-PGA在1.0 g/L濃度下具有最佳保濕效果，且保濕效果基本不受環境濕度的影響，驗證了γ-PGA作為化妝品保濕劑的功效。在納豆中，納豆黏性膠體的主要組成成分就是γ-PGA，日本已將γ-PGA列入促進化妝品及保健品吸收的成分表中。

5.5 γ-PGA在食品領域的應用

在食用領域，高分子量的γ-PGA可對食物分子進行包埋，進而掩蓋食物的苦澀味。與高分子量的γ-PGA相比，低分子量γ-PGA更具有低溫保護活性[48]。低分子量的γ-PGA可抑制冰晶生長，減少食物中可凍結水量，避免食物結構被冰晶破壞，從而增加冷凍面食的儲藏性。γ-PGA中羧基基團在與淀粉發生交聯作用后可達到抑制淀粉吸水膨脹的效果，也可使淀粉微觀結構更加致密，改善淀粉的流變學性質[49]。將γ-PGA作為食品添加劑添加到酸奶中，隨著γ-PGA濃度的不斷增加，γ-PGA分子所占體積不斷增大，吸附水分子增多，酸奶體系的黏稠度數也隨之上升[50]。

6 結語

γ-PGA良好的吸附性、保水性和生物可降解性使其應用范圍日益廣泛，研究也日益深入。目前，國外對于γ-PGA在醫藥和環保領域的應用研究頗多，尤其是可作為藥物載體對藥物起到緩釋的價值，而我國對γ-PGA的研究注重于生產菌株的選育和發酵條件的優化，且大多研究都處于實驗室階段，距離實現產業化應用還有一定的距離。在高產菌株的選育過程中，多使用誘變方法，而有研究表明采用基因工程和代謝工程更有力于菌株的篩選，因此在未來的研究中可利用上述2種工程對菌株篩選方法進行優化，以達到高效定向篩選的目的。γ-PGA的相對分子質量直接影響到其理化性質及應用范圍，但對影響機制的研究還處于初級階段，未來利用分子生物學等理論解釋該影響機制可作為γ-PGA研究的重點方向之一。同時，還需建立工藝簡單、發酵條件溫和且成本低廉的生產工藝，擴大γ-PGA的應用范圍，為γ-PGA的進一步發展奠定基礎。

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