云杉屬樹種體細胞胚成熟影響因素研究進展

依巴代提·木合旦爾 伊達婭提·木合旦爾

摘要 云杉屬樹種體細胞胚胎發生及植株再生能力受多種因素的影響。體細胞胚萌發困難的一個重要原因就是體細胞胚沒有經過一個完整的成熟過程。體細胞胚的成熟受到多方面因素的影響，包括物理因子、糖類、PEG、基因型、植物生長調節劑、成熟時間和各種離子等因素。綜述了云杉屬樹種體細胞胚成熟影響因素的研究進展，發現只有云杉屬樹種體細胞胚真正成熟并同步萌發，才可以利用云杉屬樹種體細胞胚進行工廠化育苗。

關鍵詞 云杉屬;體細胞胚;成熟;因素

中圖分類號 S718.46 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）18-0011-03

Abstract Somatic embryogenesis and plant regeneration ability of Picea were affected by many factors.One of the important reasons for the difficulty of somatic embryo germination is that somatic embryo does not go through a complete maturation process.The maturation of somatic embryos is influenced by many factors， including physical factors， sugars， peg， genotypes， plant growth regulators， maturation time， and various ions. Through the factors affecting the maturation of somatic embryos，the real mature and synchronous germination of somatic embryos of Picea were described，which could be used to improve the yield and quality of somatic embryos of Picea and to carry out industrial seedling raising.

Key words Picea;Somatic embryo;Mature;Factors

云杉（Picea）屬松科較重要的一個屬，為裸子植物松科的常綠喬木，云杉屬樹種全世界約有40種，主要分布在亞洲、北美洲和歐洲。我國云杉屬樹種資源豐富，有17種9變種，另引種栽培2種[1-7]。云杉屬樹種具有適應性強、抗逆性強等特性，廣泛用于造林和園林綠化[1]。另外，云杉屬樹種在山地森林中分布最廣、蓄積量最大，是構成森林生態系統的主體，對維持山地乃至區域生態系統平衡和改善生態環境質量等方面具有舉足輕重的作用[6，8]。云杉屬樹種的種子繁殖需要4～5年才能獲得可移栽的幼苗，生長較慢，自然育種與優良基因型選擇效率較低[7，9]，在涵養水源、保持水土、保護山區牧業基地和提供建筑用材等方面有著舉足輕重的作用。

體細胞胚的成熟是一個復雜的過程，既受外部因素的影響，又與本身的發育程度有關[10]。對于成熟體細胞胚的具體形態指標研究較少，多數研究將白色或象牙色不透明體細胞胚作為成熟體細胞胚的外部特征，而對于成熟體細胞胚的大小，由于物種差異沒有一個明確的規定[11]。自1985年Hakman等[12]首次報道挪威云杉（Picea abies Karst）的未成熟合子胚形成體細胞胚胎并再生完整植株以來，不同樹種的外植體誘導產生了體細胞胚，云杉屬樹種組織培養方面的研究取得了較大的進展和豐碩的成果[1，7，12-15]。云杉屬樹種天然更新不良和保障成為困惑林業工作者的一大問題[12-13]。經過近30年努力，國內外有10多種云杉屬樹種的體細胞胚胎發生。目前，已經有很多植物可以成功地誘導出體細胞胚，但在促進體細胞胚成熟，并將體細胞胚成功地轉化為植株的過程中仍存在很多問題。一些植物的體細胞胚可以順利地成長到子葉形胚階段，但萌發率很低，甚至是不萌發或萌發后為畸形苗。自Steward等[16]和Reinert[17]發現胡蘿卜根細胞離體培養可通過體細胞胚胎發生形成再生植株后，人們在大量的植物組織培養、單細胞懸浮培養、原生質體培養和花粉培養中都觀察到了體細胞胚胎發生[18-20]。1993年，已有210種植物成功地誘導出胚狀體[21]。目前研究多停留在誘導體細胞胚胎發生條件的摸索以及生理生化、組織學的研究方面[19，22]。體細胞胚胎發生技術在云杉屬樹種中的應用，為其品種改良和規?；?、產業化繁殖提供了基礎[1]，筆者綜述了云杉屬樹種體細胞胚胎成熟影響因素的研究進展。

1 物理因子對植物體細胞胚成熟的影響

1.1 光照

光照的作用主要體現在光強、光質與光照時間3個方面。鄧向陽等[23]在研究光強對花生體細胞胚發生及再生體系的建立中發現，光下體細胞胚無明顯的根端，芽端雖明顯變綠，但往往發育不充分，停滯于魚雷期或更早時期。翁浩等[24]研究不同因素對金花茶體細胞胚成熟的影響，結果表明，在紅光、藍光、綠光、白光培養條件下，只有白光誘導下體細胞胚成熟，其他光質下體細胞胚極少成熟。另外，光照對植物體細胞胚成熟的影響與培養基中糖的含量有關。當糖濃度較高時，光照對植物體細胞胚的成熟影響不大，而糖濃度較低時，光照可促進植物體細胞胚的早熟萌發。關于光照對體細胞胚成熟的影響較少。賴鐘雄等[25]、王立忱[26]研究發現，在高糖下，光照對龍眼體細胞胚成熟沒有明顯的影響;在低糖下，光照可減少胚狀體因透明化而引起的死亡，但胚狀體早熟萌發。

1.2 通風條件

在植物體細胞胚培養中，不通風，有利于體細胞胚的成熟，且體細胞胚的數量高于通風的情況。Meskaoui等[27]研究顯示密封條件可促進體細胞胚的成熟并限制早熟萌發。在密封微環境中進行黑皮云杉的成熟體細胞胚培養，其數量與正常通風條件下相比增加。

1.3 溫度

低溫冷凍可促進體細胞胚的成熟，并對體細胞胚的同步化有促進作用[10]。不同植物品種對溫度的影響不同。Bonga[28]研究發現，-5、-10、-18 ℃冰凍至少270 d，可促進體細胞胚成熟。對于冷凍促進體細胞胚成熟的方法，研究認為，與某些植物的種子需經低溫處理才會發芽類似，此類植物的體細胞胚也可能需要低溫處理才能發芽并正常發育，此類模仿種子發芽的處理，其作用可能是通過冷激的方法打開體細胞胚發芽及苗體發育的必要生理代謝機制[10，26，29]。

2 糖類

糖類作為細胞生長的碳源，不僅為體細胞胚發育提供能量，還可調節滲透壓。常用的糖類有蔗糖、麥芽糖、葡萄糖等。齊力旺等[30]研究發現用麥芽糖代替蔗糖，不但明顯提高體細胞胚的成熟頻率，而且使體細胞胚發生時間提前7 d;不添加蔗糖，3%麥芽糖+4%PEG 4000時，體細胞胚成熟頻率最高。高濃度麥芽糖（6%、9%）可促進黑松體細胞胚成熟及萌發[31]。低濃度的蔗糖一般不利于體細胞胚的成熟，但賴鐘雄等[32]在龍眼胚性愈傷組織的高頻率體細胞胚發生研究中發現，低糖不但可提高體細胞胚的發生頻率，而且減少畸形胚的出現。這可能與不同植物種類體細胞胚發育對碳源和滲透壓的特殊要求有關[10，18，20]。培養基中的糖濃度高，可使培養環境的滲透壓提高，引起細胞失水，使得體細胞胚出現脫水現象，從而促進植物體細胞胚的成熟。然而，如果培養基中的糖濃度過高，會使得植物體細胞胚出現玻璃化或培育出畸形苗[33]。張建偉等[34-35]研究表明，60和 90 g/L 2個蔗糖濃度處理下幾乎無成熟體細胞胚產生，推測可能是因為滲透壓過高，抑制了體細胞胚的產生。10和30 g/L 2個蔗糖濃度處理下獲得的體細胞胚數量較多;而30 g/L蔗糖處理下獲得體細胞胚健壯，萌發率高。因此，該試驗中最佳的蔗糖處理濃度為30 g/L，平均有168個/g。

3 PEG

乙二醇（PEG）是一種高分子量的化合物滲透劑，與一些小分子滲壓劑如蔗糖和甘露醇相比，其最大特點是本身不能滲透植物細胞壁進入細胞質，因而不會引起質壁分離，使植物組織和細胞處于類似干旱的水分脅迫之中，從而使細胞合成相應的脅迫蛋白質，調節代謝，促使體細胞胚成熟[36]。研究發現，較高濃度的PEG有明顯地促進體細胞胚成熟的作用，用PEG作培養基的滲透劑可明顯提高植物體細胞胚的成熟率。這可能是由于PEG可引起水分脅迫，抑制了體細胞內蛋白質的合成，從而調節代謝，促進體細胞胚的發育導致的。美國 Weyerhauser 公司已證明同時使用 PEG、ABA 和活性炭對改善針葉樹體細胞胚成熟和儲藏物質的形成十分有效[37]。Attree等[36-37]研究發現，沒有 ABA 時，白云杉體細胞胚不能成熟，但附加40 mmol/L PEG和100 mmol/L AgNO3時，可促進白云杉體細胞胚的成熟[10，38]。Li等[38]研究火炬松體細胞胚成熟中也有類似的發現。PEG發揮功效主要是結合碳因素一起使用，且在依賴于麥芽糖附加時，較高濃度的PEG更能增加體細胞胚成熟的頻率[39]。

4 基因型

基因型是影響植物體細胞胚發生的一個重要因素已被許多學者所認可，基因型也影響植物體細胞胚的成熟。Kintzios等[40]對甜瓜體細胞胚發生及其植株再生的影響進行研究，結果顯示，基因型明顯地影響體細胞胚發生率和體細胞胚成熟及植株再生。在14個甜瓜品種中，只有3個品種得到了充分發育的子葉胚。在4個石刁柏品種中，雖然所有的基因型都能再生小苗，但只有1種品種（Rutgers 22）成熟最好，成苗率最高。Mandal等[41]認為，紅花體細胞胚的成熟和萌發受到基因型的影響。李冬梅[42]對龍眼體細胞胚胎成熟機理的研究，依巴代提·木合旦爾等[6]對天山云杉體細胞胚的成熟及萌發條件均研究表明，基因型影響植物體細胞胚的成熟。LeluWalter 等[43]以海岸松（Pinus pinaster）控制授粉的8個基因型未成熟合子胚為外植體，結果發現胚性愈傷組織的誘導能力與基因型關系密切。因此，在開展云杉屬樹種體細胞胚胎發生研究時，為了獲得誘導能力較強的基因型，應擴大優良基因型的篩選力度。

5 ABA

脫落酸（ABA）是調節植物生長發育的一種激素，對植物體細胞胚的發生和發育具有多方面的影響，特別是在體細胞胚發育后期，即體細胞胚的成熟階段作用非常明顯。ABA調節植物體細胞胚發生過程中特異的基因表達，激活有關基因，合成胚胎特異性蛋白及體細胞胚內脂，從而促進體細胞胚的成熟[6-7，10]。研究發現，ABA可以抑制體細胞胚的過早萌發，促進體細胞胚的成熟并可提高體細胞胚的質量，而在未添加ABA的培養基上，體細胞胚形態不正常，或液泡化，或不分裂[29，44]。ABA在提高針葉樹的體細胞胚胎發生頻率及質量中有重要作用。青海云杉的體細胞胚成熟試驗表明，同時加入不同濃度的ABA，當ABA含量為30 mg/L時，2個種源1 g胚性組織獲得的正常體細胞胚數量最多。青海云杉體細胞胚發育與成熟過程中，當ABA含量為5.28 mg/L時，2個種源1 g胚性組織獲得的正常體細胞胚數量最多[45]。

6 成熟時間

成熟時間對植物體細胞胚的成熟也有很重要的作用。植物細胞胚也如同自然界中的植物一樣，不經歷一定的時間體細胞胚無法成熟萌發。成熟時間過短，植物體細胞胚成熟不夠，無法正常萌發，一般情況下可以生根，但萌芽困難，或者萌芽后葉片無法展開，也有可能發育成玻璃化幼苗。成熟時間適當，植物體細胞胚完全成熟，可以正常萌發出根和葉，后期生長良好。成熟時間過長，萌芽率有所提高，但易使根的生長受到抑制，這可能是由于根原基的分化早于芽原基的分化，體細胞胚在成熟培養基上的時間過長，使得已分化的根原基受到損壞，因此使得根的生長受到破壞。因此，把握好植物體細胞胚的成熟時間對體細胞胚的正常萌發生長也非常重要[44]。

7 各種離子

高等植物必需營養元素為N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、Zn、Cu、Mo、B、C1、C、H、H和Ni[46-47]。因植物對必需營養元素的需要量不同以及同種植物不同階段的耗量也不同，應針對具體試驗目的考慮這些離子的濃度。氮作為各種氨基酸、維生素、蛋白質及核酸的重要組成部分，對體細胞胚發生有一定的影響。培養基中氮主要以鉸態氮、硝態氮2種形式被利用，張萬軍等[48]、韓曉玲等[49]研究顯示，高氮含量對植物體細胞胚胎發生發育有重要的促進作用。磷參與細胞呼吸能量儲存轉化及釋放等重要的生命活動，并常以磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）等鹽的形式供給。鉀與碳水化合物的合成、轉移以及氮因素代謝等有密切的關系，主要由氯化鉀（KCI）、硝酸鉀（KNO3）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）等提供[47，50]。大多數植物體細胞胚胎發生機制研究主要考慮的都是氮源及一些金屬離子。胡忠等[51]對寧夏枸杞進行研究，結果發現，添加鈣離子和硝酸銀能有效地促進胚性愈傷組織的生長，形成的體細胞胚數量幾乎可達對照的2倍[51]。在未加任何激素時，分別添加碳酰氯（CoCl2）、氯化鎳（NiCl2）、氯化銅（CuCl2）、氯化鋅（ZnCl2）、氯化鎘（CdCl2）均可誘導胡蘿卜體細胞胚發生以及成熟[47，52]。

8 結語

影響體細胞胚成熟的重要因素還有很多，而且這些因素并不是單獨地起作用，往往各個因素間會互相作用，共同影響體細胞胚的成熟和萌發，因此，深入研究影響體細胞胚成熟的主要因素，找出最適合的云杉屬樹種體細胞胚成熟培養基種類、植物生長調節劑組合、培養環境、成熟時間等主要因子是成功培養體細胞胚的重要工作。這些研究將為云杉屬種質資源的保護提供理論依據，為體細胞胚胎發生在林業生產上的實際應用作出貢獻。因此，應在以后的工作中加強這方面的研究。

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