“環丙-林可霉素長效注射液”毒理學試驗研究

葉兆偉 ， 吳海港 ， 李盡哲 ， 劉錦妮 *， 姬萬民

（1.信陽農林學院生物與制藥工程學院，河南信陽 464000；2.信陽市獸藥新制劑研究與創制工程技術研究中心，河南信陽 464000；3.瑞普（天津）生物科技股份有限公司，天津空港經濟區 300308）

環丙沙星和鹽酸林可霉素是獸醫臨床中使用較為廣泛的抗生素之一，其主要用于畜禽相關細菌感染性疾病的預防與治療（孫建寧，2016；國家藥典委員會，2015）。體外聯合藥敏試驗結果顯示，環丙沙星與鹽酸林可霉素具有協同抗菌作用（吳海港等，2015；劉安述等，2012），但由于二者普通制劑在體內半衰期短，單次使用劑量較大，需要連續多次給藥才能在體內保持有效血藥濃度，容易引起藥物的順從性差（高艷等，2014；范惠敏等，2012）。因此根據環丙沙星和鹽酸林可霉素聯合抗菌活性和臨床應用需要研制出環丙-林可霉素長效注射液，為了科學、客觀地評價“環丙-林可霉素長效注射液”的安全性，依據《新獸藥注冊管理辦法》及相關法律法規的要求（中華人民共和國衛生部藥政管理局，1993），本試驗對環丙-林可霉素長效注射液進行急性毒性試驗、局部刺激性試驗和亞慢毒性試驗，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物及試劑 環丙沙星、林可霉素原料購于河南自然康生物科技有限公司，環丙-林可霉素長效注射液制備參考吳海港等（2015）的方法，生理鹽水與脫毛劑為本實驗室自制。

1.1.2 試驗動物 小鼠80只、健康成年白色家兔30只，均由鄭州大學實驗動物中心提供，合格證號 SCXK（豫）2017-0001。

1.1.3 主要儀器 A0820石蠟切片機 （Amershanm optical公司）；BHP生物顯微鏡 （奧林巴斯（中國）有限公司）。

1.2 試驗步驟

1.2.1 急性毒性試驗 預試驗：選用1月齡小鼠20只，雌、雄各半，隨機分成5組，每組4只，常規飼養。于試驗開始第1天分別按照10、7.5、5、2.5、1 mg/kg肌肉注射給藥，記錄小鼠的急性毒性反應及死亡情況，包括中毒癥狀出現的時間、死亡時間、精神、飲食、體重變化及肝臟、腎臟器官的變化。在用藥后第6天將所有試驗小鼠頸椎脫位處死，剖檢觀察其對小鼠肝臟、脾臟、腎臟及肺臟等臟器的病理變化。

正式試驗：在室溫條件下，取禁食12 h的小鼠共50只，雌雄各半，隨機將小鼠分為5組，每組10只。各組動物均以肌肉注射給藥。根據預試驗的結果確定的最高劑量組為7.5 mg/kg，其余組間劑量為1：0.8，觀察7 d，常規飼養，記錄各組動物用藥后所表現的臨床癥狀、體征、死亡數和時間，采用改良寇氏法確定環丙-林可霉素長效注射液的半數致死量（LD50）。

1.2.2 溶血試驗 按照環丙-林可霉素長效注射液臨床使用濃度（0.2 mg/kg），用生理鹽水按 1：5稀釋，將稀釋后藥液按照表1進行試驗，將各管置于37℃水浴中保溫，開始每15 min觀察試驗現象1次，試驗1 h以后采用每1 h觀察試驗現象1次，連續觀察4 h，參考中國食品藥品監督管理局（2005）對試驗結果進行判斷。

表1 溶血試驗加樣培育mL

1.2.3 肌肉刺激性試驗 參考國家食品藥品監督管理局（2005）方法，取健康家兔8只，雌雄各半，將家兔固定于固定箱內，分別于一側股四頭肌內注射環丙-林可霉素長效注射液1 mL。并以生理鹽水為對照藥物，于另一側相同部位同法注射給藥，觀察用藥部位肌肉的變化情況（如充血等）。給藥48 h后將試驗動物處死，縱向切開股四頭肌，觀察用藥部位肌肉的刺激反應。

1.2.4 皮膚刺激試驗 參考袁伯俊等 （1997）方法，取健康家兔8只，雌雄各半，體重（2.5士0.5）kg。分籠單獨飼養，于給藥前24 h沿脊椎兩側相對應部位脫毛，左側按照0.5 mL/次涂抹環丙-林可霉素長效注射，右側相對應部位按照相同劑量涂空白基質為對照，采用無刺激紗布固定。涂抹24 h后溫水沖洗擦拭，分別于不同時間內觀察涂抹部位皮膚變化情況。

1.2.5 亞慢性毒性試驗 參考徐叔云等 （2002）方法，選用健康、體重（2.5士0.5）kg的家兔24只，雌雄各半，隨機分成4組，分籠常規飼養。根據急性毒性試驗結果，環丙-林可霉素長效注射液設高劑量組（1 mg/kg）、中劑量組（0.5 mg/kg）、治療劑量組（0.2 mg/kg）和對照組（生理鹽水）。肌肉注射給藥，每天注射1次，連續注射14 d。每天觀察家兔健康狀況，包括活動、采食、飲水、發病和死亡等；于第15天稱重，并對肝臟、腎臟進行組織病理學檢查。

2 試驗結果

2.1 急性毒性試驗 高劑量組（7.5 mg/kg）表現為給藥后小鼠出現精神興奮，呼吸加快，1 min后開始搖晃，伴有共濟失調，肌肉抽搐呈劃水樣，2 min后死亡。剖檢可見肝臟顏色呈深褐色，其他器官未有明顯的眼觀變化。低劑量組（3.0 mg/kg）小鼠6 d后處死，剖檢其肝臟、腎臟未有異常。各組小鼠死亡情況見表2，應用改良寇氏法計算LD50=4.81 mg/kg，LD50的95%可信限為4.50～5.53 mg/kg。

表2 環丙-林可霉素長效注射液對小鼠急性毒性試驗結果

2.2 溶血試驗 在觀察時間內，3～6號管未見溶血和紅細胞凝聚現象，第7管溶液呈紅色透明，有溶血現象。結果表明環丙-林可霉素長效注射液0.1～0.3 mL在4 h內對紅細胞不產生溶血和凝聚作用。

2.3 肌肉刺激性試驗 給藥后各家兔健康如常，其對肌肉刺激性試驗結果見表3。從結果中可以看出環丙-林可霉素長效注射液具有輕度的肌肉刺激反應，其范圍在0.5 cm×1.0 cm以下，肌肉刺激性反應級的最高與最低之差等于0，家兔肌肉刺激性反應之和小于10，表明環丙-林可霉素注射液的局部刺激試驗符合規定。

表3 肌肉刺激性反應分級結果

2.4 皮膚刺激試驗 由表4可知，環丙-林可霉素長效注射液在涂抹后未對家兔皮膚產生刺激作用，表明環丙-林可霉素注射液的皮膚刺激性試驗符合規定。

表4 皮膚刺激性的評價

2.5 亞慢性毒性試驗

2.5.1 體重變化 正常治療劑量組與中劑量組家兔的體重基本變化不大，與對照組比較，差異不顯著。高劑量組體重增長低于對照組和臨床劑量組，并表現出精神不振、呆立或臥地不起、食欲減少等癥狀，表明高濃度藥物對家兔體重有一定的影響。

2.5.2 肝臟、腎臟組織形態學 肉眼觀察家兔的腎臟未見明顯病理學變化，肝臟稍有腫大，周圍顏色較深。通過組織切片觀察，治療劑量組腎小球形態完整，無出血；中劑量組腎小球內有散在的出血，胞漿出現液化，腎小管形態正常；高劑量組腎小球內有大量出血，，腎間質出現壞死，散在血細胞、管上皮正常形態消失。常規劑量組肝索有序，肝血竇未見出血、壞死；中劑量組家兔肝臟主要表現為肝血竇、中央靜脈有出血，肝細胞間隙增大；高劑量肝細胞排列紊亂，肝細胞腫脹融合，肝血竇間有大量出血和炎性細胞。

3 討論

急性毒性試驗是藥物及制劑安全性評價的重要內容，是評價受試化學物急性毒性大小的主要參數，可以根據半數致死量（LD50）的結果判斷該藥物的毒性大小及其作用靶器官。為亞急性、慢性毒性試驗設計提供資料（樓宜嘉，2011）。通常LD50值越小，化合物的毒性就越大，對靶動物和人產生危害的可能性也就越大 （沈建忠，2011）。研究表明，環丙沙星LD50小鼠口服為＞5000 mg/kg，大鼠為＞2000 mg/kg；小鼠及大鼠皮下注射均＞1000 mg/kg（劉明亮，2012）。 賈海艷等（2010）報道，慶大霉素和林可霉素注射液對小鼠肌肉注射的LD50為4.989 mL/kg。本研究結果顯示，環丙-林可霉素長效注射液小鼠靜脈注射LD50為 4.81 mg/kg，LD50的95%可信限為4.50～5.53 mg/kg，表明藥物的急性毒性與藥物制劑、藥物輔料以及聯合使用藥有關，尤其是聯合用藥，其提高治療作用同時也增加了藥物的毒副作用。

體外紅細胞溶血性、局部刺激性及過敏性等是藥物安全性評價的重要指標（馮小花，2007）。漆俊等（2012）以乳酸環丙沙星和乳酸甲氧芐定研制出了復方環丙沙星乳劑。該制劑對家兔肌肉注射給藥不產生熱源反應，無體外溶血性或凝集反應，不產生明顯的肌肉刺激性反應，也不產生明顯全身過敏性反應；萬軍梅等（2013）對復方環丙沙星燒傷凝膠毒理學進行研究表明，該制劑無明顯急性毒性和致敏作用，未見其對家兔完整皮膚和破損皮膚有明顯刺激作用。本試驗結果表明，環丙-林可霉素長效注射液無明顯刺激性，對試驗動物無致敏性，無體外溶血性，提示慶大霉素和林可霉素注射液肌內注射給藥符合安全性要求。

臟器是機體發揮生理功能的場所，其形態結構改變將直接影響機體的正常功能，因此病理學檢查是評價藥物毒性及安全性的直接指標 （邢守葉等，2015）。林曉輝（2015）報道，高劑量使用環丙沙星后大鼠血漿中，異染粒有增加的趨勢，在其尿液中出現了黃色針狀的結晶。賈海艷（2010）研究表明，高劑量使用復方林可霉素注射液對腎臟存在一定的毒性，對肝臟功能的影響較小。而本試驗結果表明，環丙-林可霉素長效注射液治療劑量和中劑量組肝臟和腎臟組織結構清晰，而高劑量組腎小球內有大量出血，腎間質出現壞死，肝細胞排列紊亂，肝細胞腫脹融合，肝血竇間有大量出血。從細胞形態觀察可以說明環丙-林可霉素長效注射液有一定的毒性作用，但作用機制有待進一步研究。