植物乳桿菌凍干保護劑的篩選及凍干工藝的研究

張 菊， 蘇成文， 亓 鵬， 陳 焱， 孫得發

（山東畜牧獸醫職業學院，山東濰坊 261061）

真空冷凍干燥（簡稱為凍干）是目前制備和保藏微生物的有效方法，凍干是將冷凍技術和干燥技術進行有機結合。微生物在真空冷凍干燥過程中要經受冷凍和干燥兩種激烈因素的影響，損傷是難以避免的。乳酸菌在真空冷凍干燥過程中，通常會造成細胞膜通透性發生改變、蛋白質變性失活、pH的動態平衡被打破、DNA發生損傷以及膜脂肪酸組成發生改變等（張英華等，2006）。影響乳酸菌在凍干后效果的因素有很多，如菌株、菌體的大小及其形狀、菌種的菌齡、初始菌種的濃度、pH、相應的保護劑系統、預凍的溫度、降溫的速率、冷凍干燥的條件、細胞的含水量、細胞膜的成分和復水的條件等（李華等，2002），若在凍干的過程中采取一定的保護措施，加入適宜的有效保護劑系統，同時采用適合特定菌株的預凍溫度和預凍時間，可以在最大程度上減輕或有效避免真空冷凍干燥對細胞帶來的損傷。

低聚糖又稱為寡糖，由2～10個單糖分子通過糖苷鍵聚合而成的直鏈或支鏈化合物，其包括功能性低聚糖和普通低聚糖。功能性低聚糖一般很難被消化吸收，但是可以被腸道中的微生物發酵利用。其具有增加胃腸道蠕動、提高機體免疫力、抗病毒、抑制腐敗菌生長、促進有益菌增殖等一系列特殊的生理保健作用。功能性低聚糖作為凍干保護劑，具有保健和凍干保護的雙重作用，可以使益生菌維持較高的成活率；當機體食入功能性低聚糖作為益生菌凍干保護劑的產品后，功能性低聚糖將繼續發揮益菌保健、促生長的作用（王瑩等，2010），功能性低聚糖可以將益菌作用和凍干保護作用結合起來，將在醫藥、食品和飼料生產中發揮重要的作用。

本試驗選擇目前益菌和促菌生長效果比較好的功能性低聚糖：低聚木糖、低聚果糖、水蘇糖、低聚異麥芽糖，分別研究其對植物乳桿菌凍干后的保護效果，選擇其中一種功能性低聚糖作為凍干保護劑。再與目前乳酸菌凍干效果比較好的脫脂奶粉、海藻糖和甘油復配，通過正交試驗對其濃度進行優化。同時對凍干工藝進行初步探索，旨在為植物乳桿菌的凍干保護研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養基 植物乳桿菌：本實驗室保存的菌種。

培養基：MRS固體和液體培養基。

1.2 原料 低聚木糖、低聚果糖、水蘇糖、低聚異麥芽糖、海藻糖（純度＞99%）和脫脂奶粉為食品級，甘油為化學純。以上保護劑分別用蒸餾水配制成高濃度的貯備液，單獨滅菌后，按試驗設計配制成各種復合保護劑。

1.3 儀器與設備 微生物實驗室常用的儀器設備為：FDU-1100真空冷凍干燥機（日本，東京理化），SW-CJ-2F垂直流雙人雙面凈化工作臺 （江蘇，蘇州凈化），DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱（西安禾普）和DHP-360數顯電熱恒溫培養箱（江蘇，金壇市天竟實驗儀器廠），TCYQ DHZ-CA大容量振蕩器（江蘇，太倉市實驗設備廠），DW-86L578J超低溫冰箱（青島海爾），高速冷凍離心機（德國 sigma，3-18K）等。

1.4 菌株的培養和懸浮液的制備 植物乳桿菌經MRS固體斜面培養基傳代活化恢復活力后，接入滅菌后的MRS液體培養基中，置于37℃恒溫培養箱培養12 h左右，以此作為植物乳桿菌的種子液。以1%的量再次接種入滅菌后MRS液體培養基中，使植物乳桿菌處于對數生長期后期，然后分裝于50 mL無菌離心管中，置于高速冷凍離心機（10000 r/min），4 ℃離心 10 min，棄去上清液，將菌泥稱重后按照1：1的比例加入滅菌生理鹽水（0.9%的濃度），用小型快速振蕩器快速混合均勻后，制成植物乳桿菌的菌懸液，取2 mL菌懸液進行計數（作為凍干前的活菌總數），再將剩余的菌懸液分裝于無菌的10 mL凍干管中，每管2 mL菌懸液，按照試驗的具體要求加入相應的凍干保護劑。

1.5 冷凍干燥 將上述制備好的菌懸液置于-20℃（或-70℃）的溫度下預凍，等其完全凍結后，迅速將凍結樣品移入真空冷凍干燥機中冷凍干燥24～48 h，使凍干后菌粉的含水量達3%左右，然后測定凍干后植物乳桿菌的活菌數。

1.6 菌落總數測定 參考國家標準GB 4789.35-2016乳酸菌檢驗方法，測定植物乳桿菌的菌落總數。存活率計算公式為：

1.7 凍干保護劑配方的選擇 首先進行功能性低聚糖的單因子試驗，挑選對植物乳桿菌凍干后保護效果最佳的功能性低聚糖，再選擇脫脂奶粉、海藻糖和甘油，進行最優復合保護劑配方的篩選。通過設計4因素3水平的正交試驗L9（34）確定最優植物乳桿菌復合保護劑配方組合。

1.8 預凍溫度和預凍時間 將上述制備好的菌懸液統一加入上述篩選的最優復合保護劑后，分別置于-20℃和-70℃的低溫條件下預凍2、4、6 h，將樣品完全凍結后取出，然后對其進行真空冷凍干燥，最后進行活菌計數，計算出冷凍干燥后植物乳桿菌的存活率。

1.9 菌泥與水混合比例的選擇 植物乳桿菌的菌泥與水的比例分別按 0.25：1、0.50：1、0.75：1、1.00：1、1.25：1進行混合，統一加入上述篩選的最優復合保護劑后轉入凍干管中，然后將其進行真空冷凍干燥后進行活菌計數，計算出冷凍干燥后植物乳桿菌的存活率。

2 結果與分析

2.1 功能性低聚糖單因子的試驗結果 由表1可知，所選的四種功能性低聚糖均對乳酸菌凍干有較好的保護效果，起保護效果的順序依次為：低聚木糖＞低聚果糖＞水蘇糖＞低聚異麥芽糖。為達到較好的試驗效果，本試驗以低聚木糖作為研究對象，對乳酸菌凍干保護劑最佳配方的選擇。

表1 功能性低聚糖單因子的試驗結果

2.2 正交試驗設計優化復合保護劑 脫脂奶粉是一種凍干效果較好的大分子物質，在冷凍干燥時，奶粉中的乳清蛋白能在菌體外形成蛋白膜保護層，對細胞加以保護，同時可固定凍干酶類；奶粉中其他成分也有助于提高菌體的凍干存活率（徐致遠等，2006）。海藻糖是一種二糖，由兩個葡萄糖構成，具有大量的自由羥基，是具有極強穩定性的非還原性雙糖，玻璃化溫度更高，吸濕性更低，在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜，保護蛋白質分子不變性失活（張敬如等，2006）。甘油（又稱丙三醇）是一種多羥基化合物，能滲透到細胞內部。在凍干過程中可部分取代水分子與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團 （或者與菌體蛋白質極性基團）形成氫鍵，使菌體中的大分子物質在缺水狀態下仍能保持原有的功能結構，維持菌體活力（朱敖蘭等，2007）。

根據文獻報道和試驗結果（索江華等，2015；張炎等，2015；熊濤等，2011；張英華等，2006）選擇脫脂奶粉、海藻糖、甘油和低聚木糖進行正交試驗優化植物乳桿菌的最佳配方組合，不同比例保護劑在凍干后對植物乳桿菌存活率的影響如表2所示。

表2 植物乳桿菌凍干保護劑篩選

通過直觀極差分析法可以看出（表2），影響因素依次為 D（低聚木糖）＞A（脫脂奶粉）＞B（海藻糖）＞C（甘油），得出最佳配方組合為：A3B2C2D3，即奶粉20%，海藻糖10%，甘油2%，低聚木糖5%。2.3 最佳配方的試驗驗證 由于最佳的配方組合未包含在正交試驗的9個試驗中，為了進一步確定凍干保護及配方的試驗效果，按照最佳組合A3B2C2D3，再次做了三次驗證試驗，每次試驗兩個重復，其存活率均為80%左右（表3）。

表3 最佳組合的試驗驗證

2.4 預凍溫度和預凍時間的確定 試驗選擇-20、-70℃，時間為2、4 h和6 h。預凍溫度及凍結時間對植物乳桿菌存活率的影響見表4。由表4的結果可以看出，預凍溫度對所研究的植物乳桿菌的影響不大。隨預凍時間延長，植物乳桿菌存活率緩慢上升。根據試驗結果得出，預凍的最適宜條件：預凍時間6 h，預凍溫度-70℃。

表4 預凍溫度和預凍時間對植物乳桿菌存活率的影響

2.5 菌泥與水混合比例的確定 由表5可知，菌泥與水的混合比例對植物乳桿菌的凍干存活率也有一定影響作用。菌泥太多，水的量太少，加入保護劑后容易攪拌不均勻，影響真空冷凍干燥后產品的性狀。本試驗結果表明，水的含量越少，凍干后菌體的存活率最高，而且凍干時間縮短，節約能耗。但是水的量也不能加入太少，要保證凍干保護劑、菌泥和水混合均勻，建議水與菌泥最佳比例為0.5：1。

表5 水與菌泥混合比例對植物乳桿菌存活率的影響

3 討論

功能性低聚糖（或稱寡糖）因其獨特的生理功能，在營養保健、疾病預防、畜牧生產養殖等方面得到廣泛的應用。目前已成功開發的功能性寡糖有低聚果糖（FOS）、低聚木糖（XOS）、低聚異麥芽糖（IMO）、大豆低聚糖（SBOS）、甘露寡糖（MOS）、低聚半乳糖（GOS）、低聚異麥芽酮糖、低聚龍膽糖、低聚殼聚糖和水蘇糖等（閔力等，2012）。功能性低聚糖一般不被人和動物腸道所分泌的消化酶消化，但其可以明顯促進腸道有益菌的增殖，抑制腸道病原菌的繁殖，從而調節腸道微生物菌群的平衡，有益于人和動物腸道菌群的健康，最終提高機體的免疫能力。目前研究發現功能性低聚糖也會調節動物體內的脂類代謝和蛋白質代謝，同時增強動物對礦物質（如鈣元素）的吸收等多種生理作用（劉紅梅等，2012；朱俊玲等，2003）。功能性低聚糖具有無毒副作用、無殘留、無耐藥性、綠色、安全、環保和穩定性強等特點，對功能性低聚糖的深入研究和開發應用具有廣闊的發展前景。

目前，關于功能性低聚糖的益菌作用研究比較廣泛，但是作為益生菌凍干保護劑的研究還不是很深入，功能性低聚糖含有2～10個相同或不同的單糖，每個單糖均含有自由羥基，在凍干過程中的作用機理與甘油類似，其羥基可部分取代水分子與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團 （或者與菌體蛋白質極性基團）形成氫鍵，使菌體中的大分子物質在缺水狀態下仍能保持原有的功能結構。Schwab等（2007）發現，低聚果糖能明顯提高乳酸桿菌TMW1.106在干燥以及存儲過程中的存活率，推測低聚果糖可以提高乳酸桿菌細胞膜的完整性，增加細胞膜的側壓力，最終細胞膜的流動性得到提高，導致存活率提高。功能性低聚糖通過覆蓋在生物分子表面，保持了細胞表面的溶劑化和天然性質，維持在冷凍干燥狀態下乳酸菌細胞中水的含量，從而適度保存和避免其不受傷害（Noori等，2017）。

微生物制劑在真空冷凍干燥之前，首先要進行預凍處理。預凍是將溶液中的自由水進行固化，使真空干燥后產品的形態不發生變化，防止在真空干燥時發生起泡、濃縮、收縮和溶質移動等不可逆的變化，減少由于溫度下降引起的物質可溶性降低以及生命特性發生變化（王娜等，2011）。純水可以在0℃固化結晶，但不同物料中的液體是含有不同溶質的水溶液，所以導致其凍結溫度各不相同，將物料中水溶液完全凍結時的溫度稱為其共晶溫度。不同物質、同一物質含水量不同，其共晶溫度也隨之變化。預凍溫度和預凍時間也是影響整個凍干周期的重要因素，許多觀點認為生物體在快速降溫的過程中，細胞內冰晶的產生是細胞損傷的主要原因（Shao等，2014）。

本試驗結果表明，四種低聚糖對植物乳桿菌的保護率效果依次為：低聚木糖＞低聚果糖＞水蘇糖＞低聚異麥芽糖，選擇低聚木糖與目前乳酸菌凍干效果比較好的脫脂奶粉、海藻糖和甘油復配，通過正交試驗對其濃度進行優化，得出最佳配方組合為：奶粉20%，海藻糖10%，甘油2%，低聚木糖5%。進一步驗證試驗結果表明，其存活率為80%左右。對植物乳桿菌凍干工藝的研究發現，最佳的預凍溫度和時間分別是-70℃，6 h；菌泥與水不同比例混合凍干后，隨著水分的增加，植物乳桿菌菌的存活率緩慢下降，建議水與菌泥最佳比列為0.5：1。經過凍干保護劑和凍干條件的優化，植物乳桿菌的存活率達到80%以上。通過對植物乳桿菌的凍干保護劑和凍干工藝的優化，可以為以后植物乳桿菌的凍干研究提供理論參考。