激素和抑制劑對(duì)乳腺組織形態(tài)和乳蛋白合成的影響

田 青， 王海平， 黃和升， 梁天林， 李 萌

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003；2.江蘇大川生物科技有限公司，江蘇淮安223003）

研究發(fā)現(xiàn)INS、PRL和HYD等激素可以調(diào)節(jié)乳蛋白的合成 （Pauloin等，2012；Xudong等，2011；Burgos等，2010）。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果也表明，INS、PRL和HYD單獨(dú)或聯(lián)合作用都能增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖和促進(jìn)乳蛋白的合成（田青等，2014、2013），并且田青等（2016、2015）還證明這種調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)mTOR和JAKSTAT信號(hào)通路發(fā)揮的。Qian（2009）和Burgos（2010）提出AG-490是一種對(duì)JAK2激酶選擇性抑制的抑制劑，能夠阻止JAK2-STAT5A信號(hào)通路作用的發(fā)揮。Pauloin等（2012）提出LY294002是一種PI3K激酶選擇性抑制劑，能夠抑制mTOR信號(hào)通路作用的發(fā)揮。為了確定前期研究結(jié)果在體內(nèi)和體外是否一致，本試驗(yàn)選用泌乳期Wistar大鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，分別選用LY294002和AG-490來(lái)抑制mTOR和JAK-STAT信號(hào)通路，然后通過(guò)對(duì)新生仔鼠的平均日增重、泌乳大鼠平均產(chǎn)奶量、大鼠乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、血漿和乳腺組織中激素和蛋白基因的表達(dá)等指標(biāo)的測(cè)定來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 從揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究中心購(gòu)買(mǎi)平均體重為（200±20）g的Wistar大鼠，采用12 h光照，12 h黑暗的交替光照控制法，在相對(duì)溫度15～20℃，相對(duì)濕度50%～70%的條件下飼養(yǎng)，全程自由飲水，自由采食。

1.2 試驗(yàn)處理 經(jīng)過(guò)3 d的產(chǎn)后修復(fù)，母鼠連同出生仔鼠以窩為單位隨機(jī)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6窩，每窩一只母鼠，6只仔鼠。從第4天開(kāi)始，對(duì)照組母鼠每隔1天定時(shí)（早晨8：00）肌肉注射生理鹽水2 mL，試驗(yàn)組母鼠每隔1天定時(shí)（早晨8：00）分別按照表1的設(shè)計(jì)方案肌肉注射2 mL，試驗(yàn)期14 d。每天記錄大鼠的泌乳量和仔鼠日增重。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 大鼠平均泌乳量的測(cè)定 參照Silberstein（1987）的方法進(jìn)行，即以窩為單位，每天早晨8：00將仔鼠與母鼠分開(kāi)，4 h后以窩為單位稱(chēng)重仔鼠，之后立刻放回到母鼠身邊開(kāi)始哺乳，60 min后再次以窩為單位稱(chēng)重仔鼠 （在此期間仔鼠禁食禁水），兩次稱(chēng)重的體重差即大鼠平均泌乳量。

1.4 仔鼠平均日增重的測(cè)定 試驗(yàn)期末仔鼠窩平均體重與試驗(yàn)始仔鼠窩平均體重的差除以試驗(yàn)期天數(shù)（14）即得仔鼠平均日增重。

ADG/g=[試驗(yàn)期末仔鼠窩平均體重 （g）-試驗(yàn)始仔鼠窩平均體重 （g）]/14。

1.5 血漿和組織樣的收集與準(zhǔn)備 最后1次泌乳量測(cè)定完成后，母鼠用10%水合氯醛以10 mL/kg體重的劑量腹腔注射麻醉，之后心臟采血5 mL，4000 r/min離心15 min，收集血漿，分裝后-20℃保存。采血后，立即采集右側(cè)靠近尾部的三對(duì)乳腺組織，液氮保存，用于測(cè)定組織蛋白含量。收集左側(cè)腹股溝處最大的乳腺組織，10%的中性甲醛固定，用于大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)測(cè)定。

1.6 大鼠乳腺組織切片的制備 固定：無(wú)菌采取乳腺組織樣本后立即轉(zhuǎn)移至含有5 mL 10%中性甲醛無(wú)菌試管固定24 h，然后將組織轉(zhuǎn)移至另外一只含有5 mL 10%中性甲醛的試管中保存。

脫水：固定后的組織分別在70%、80%和90%的酒精中連續(xù)脫水3 h。

透明：脫水后的組織先轉(zhuǎn)移至二甲苯溶液中20 min，然后用新鮮的二甲苯溶液重復(fù)孵育20 min。

透蠟：二甲苯處理后的組織轉(zhuǎn)移至65℃溶解石蠟中包埋40 min，然后重復(fù)此操作1次。

包埋：將浸蠟后的組織轉(zhuǎn)移至溶解的石蠟?zāi)ゾ咧校怪杆倌坛上瀴K。

切片：用顯微鏡薄片切片機(jī)將石蠟包埋的組織切成3～4 μm的薄片，將薄片放入溫水（40 ℃）中展開(kāi)并小心轉(zhuǎn)移至載玻片上，自然晾干。

染色：將干燥的切片放入二甲苯溶液中5～10 min，如此再重復(fù)一次，溶去切片上的石蠟，隨后將切片依次放入無(wú)水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min后即可按照蘇木精和HE染色試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。切片先用蘇木精染液染色5～10 min，進(jìn)入自來(lái)水10 min，隨后用蒸餾水洗去殘留的染液。接著用95%乙醇潤(rùn)洗5 s，伊紅染色0.5～2 min，70%乙醇潤(rùn)洗后用95%乙醇脫色2次，每次2 min。隨后，二甲苯清洗2次，每次5 min。最后，用中性橡膠密封切片，用顯微鏡觀(guān)察。藍(lán)色為細(xì)胞核，粉紅色或紅色為胞質(zhì)。

1.7 大鼠乳腺組織和血漿中酪蛋白和激素含量的測(cè)定 用上海碧云天公司增強(qiáng)型BCA蛋白測(cè)定試劑盒，根據(jù)其說(shuō)明書(shū)對(duì)液氮中保存的大鼠乳腺組織進(jìn)行處理，總蛋白、總酪蛋白和κ-酪蛋白的含量用上海悅顏生物有限公司大鼠總蛋白、總酪蛋白和κ-酪蛋白ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。INS、PRL和HYD水平也用上海悅顏生物有限公司的ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SAS 9.1軟件中單因素方差分析和Tukey法進(jìn)行多重比較。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素和抑制劑對(duì)泌乳期大鼠乳腺組織形態(tài)的影響 與對(duì)照組相比，PRL、HYD和INS三種激素聯(lián)合作用組細(xì)胞呈典型的圓形和橢圓形，細(xì)胞大小均勻，乳導(dǎo)管分布明顯，說(shuō)明三種激素聯(lián)合作用對(duì)泌乳期大鼠乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)無(wú)顯著影響，但是細(xì)胞信號(hào)通路抑制劑LY294002和AG-490添加組細(xì)胞形態(tài)不完整，乳導(dǎo)管分布也不規(guī)則，推測(cè)可能是抑制劑對(duì)正常細(xì)胞的形態(tài)損傷造成的。

2.2 外源激素和抑制劑對(duì)泌乳期大鼠平均泌乳量和新生仔鼠平均日增重的影響 由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，激素組合與兩種抑制劑對(duì)泌乳期大鼠平均泌乳量和平均日增重的影響差異不顯著（P＞0.05）。但是，在各試驗(yàn)組之間，8 d和14 d時(shí)試驗(yàn)3組母鼠的平均泌乳量比試驗(yàn)1組分別增加20.75%和7.04%，比試驗(yàn)2組分別增加了 13.65%和 8.84%（P ＜ 0.05）；10 d時(shí)，試驗(yàn)3組仔鼠平均日增重較試驗(yàn)2組降低了45.81%（P ＜ 0.05）。

2.3 外源激素和抑制劑對(duì)泌乳期大鼠血漿總蛋白和激素水平的影響 由圖1可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，激素組合與兩種抑制劑對(duì)泌乳期大鼠血漿總蛋白含量的影響差異不顯著（P＞0.05），但各試驗(yàn)組血漿總蛋白水平均低于對(duì)照組。

表2 新生仔鼠平均日增重和泌乳大鼠平均泌乳量分析

由圖2～圖4可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)1、2、3組血漿INS水平分別降低3%、4.98%和4.12%，試驗(yàn) 1、2、3組血漿 HYD水平分別降低 3.07%、5.04%和4.17%，而試驗(yàn)1、2、3組血漿PRL水平分別降低3.75%、4.66%和4.45%（P＜0.05）。各試驗(yàn)組之間，血漿催乳素水平差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 外源激素和抑制劑對(duì)泌乳期大鼠乳腺組織酪蛋白含量的影響 由圖5可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)1、2、3組對(duì)大鼠乳腺組織中總蛋白含量的影響差異不顯著 （P=0.071），但在各試驗(yàn)組之間，試驗(yàn)2、3組大鼠乳腺組織中總蛋白含量低于試驗(yàn)1組，降低了20.79%和30.94% （P＜0.05）。

由圖6和圖7可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，不管是激素的復(fù)合作用還是抑制劑，均顯著降低了大鼠乳腺組織中k-酪蛋白和總酪蛋白的含量，其中試驗(yàn)1、2、3組組織中k-酪蛋白的含量與對(duì)照組相比分別降低了4.06%、3.28%和3.01%，組織中總酪蛋白含量與對(duì)照相比分別降低了4.48%、3.47%和3.07%（P＜0.05），但各試驗(yàn)組之間差異均不顯著（P＞0.05）。

2.5 外源激素和抑制劑對(duì)泌乳期大鼠乳腺組織激素水平的影響 由圖8～圖10可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，不管激素復(fù)合作用還是抑制劑，均對(duì)大鼠乳腺組織中催乳素水平無(wú)顯著影響（P＞0.05），但均顯著降低了乳腺組織中胰島素的水平，試驗(yàn)1、2、3組與對(duì)照組相比分別降低了11.62%、11.26%和6.41%（P ＜ 0.05），對(duì)氫化可的松而言，AG-490抑制劑顯著增加了乳腺組織中HYD水平，與對(duì)照組相比增加了2.69%（P＜0.05），其他各組間差異不顯著（P ＞ 0.05）。

3 討論

3.1 外源激素和抑制劑抑制了大鼠乳腺組織中乳蛋白的合成 試驗(yàn)研究結(jié)果表明，外源激素和抑制劑對(duì)大鼠血漿總蛋白含量無(wú)影響，卻顯著降低了血漿激素含量。在乳腺組織中，除外源激素的聯(lián)合作用對(duì)乳腺總蛋白含量略有上升外，外源激素和抑制劑均顯著降低了大鼠乳腺組織中總酪蛋白和k-酪蛋白的含量，與Tian等（2015）研究結(jié)果看似不一樣但卻也不矛盾。其原因可能是，體外研究的環(huán)境較為單一，基本上是在無(wú)任何其他激素干擾而僅僅聚焦于待研究激素的情況下，而體內(nèi)的情況更復(fù)雜，對(duì)于本試驗(yàn)所選擇的健康泌乳期的大鼠，本身就具有相對(duì)平衡和強(qiáng)大調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源激素系統(tǒng)，在外源激素和抑制劑注射后反而會(huì)影響機(jī)體固有內(nèi)分泌系統(tǒng)的平衡。因此，在機(jī)體固有內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下，為了維持這種平衡會(huì)額外消耗蛋白合成的前體物、能量而造成原有內(nèi)分泌系統(tǒng)的短暫紊亂，這就導(dǎo)致了血漿總蛋白、k-酪蛋白和組織蛋白含量的顯著下降。

Tian 等（2016）研究結(jié)果表明，LY294002 可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，同時(shí)也會(huì)下調(diào)mTOR信號(hào)通路和JAK-STAT信號(hào)通路中相關(guān)基因和激素受體基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制CSN3基因的表達(dá)，這和本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中血漿和乳腺組織中激素水平的變化情況也驗(yàn)證了蛋白質(zhì)水平變化的結(jié)果和分析。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，外源激素和抑制劑均顯著降低了泌乳期大鼠血漿中的激素水平，使乳腺的激素水平更加雜亂。與對(duì)照組相比，除AG-490顯著增加了乳腺組織中氫化可的松水平外，外源激素和抑制劑對(duì)其他組催乳素和氫化可的松含量影響不大，但對(duì)胰島素，外源激素和抑制劑依然顯著降低了其在乳腺組織中的水平，這和蛋白質(zhì)層面的試驗(yàn)結(jié)果正好呼應(yīng)。因此，建議在動(dòng)物疾病或機(jī)體代謝紊亂的情況下，可以通過(guò)注射外源性激素來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)源性激素的平衡；而在健康動(dòng)物的正常生理水平下，則無(wú)需外援干涉。

3.2 抑制劑顯著破壞了大鼠乳腺組織結(jié)構(gòu) 乳腺是產(chǎn)乳和乳蛋白合成的主要場(chǎng)所。腺泡是乳腺的實(shí)質(zhì)部分，是乳腺的功能單位，在乳蛋白的合成和分泌、乳汁的排出等過(guò)程中起作用，可將血液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳汁。此外，Silberstein（1987）和Yang（2005）發(fā)現(xiàn)，乳腺間質(zhì)具有保護(hù)和支持乳腺組織的功能，其發(fā)育和功能狀態(tài)直接影響哺乳動(dòng)物的產(chǎn)乳和產(chǎn)奶質(zhì)量。在妊娠期和哺乳期，多種生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞外基質(zhì)參與調(diào)節(jié)乳腺細(xì)胞的增殖、分化和泌乳。本試驗(yàn)結(jié)果表明，外源激素組細(xì)胞呈典型的圓形和橢圓形，細(xì)胞大小均勻，乳導(dǎo)管分布明顯，說(shuō)明其對(duì)泌乳期大鼠乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)無(wú)顯著影響，但是LY294002和AG-490組細(xì)胞形態(tài)不完整，乳導(dǎo)管分布也不規(guī)則。結(jié)合泌乳大鼠血漿和乳腺組織的激素分泌情況，推測(cè)產(chǎn)生此結(jié)果的可能原因是抑制劑組是在額外添加外源激素的同時(shí)添加抑制劑，外源激素單獨(dú)作用雖然造成了健康的泌乳期大鼠內(nèi)分泌的紊亂，但還沒(méi)有達(dá)到損傷乳腺組織的程度，而抑制劑組在造成了內(nèi)分泌紊亂的同時(shí)，還造成轉(zhuǎn)錄水平或蛋白翻譯水平的部分中斷，致使乳腺組織結(jié)構(gòu)受到損傷。 Brisken（1999）和 Clevenger（2003）等多項(xiàng)研究表明，哺乳動(dòng)物的PRL可以通過(guò)自分泌和旁分泌信號(hào)調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)泌乳和維持泌乳。對(duì)于乳腺形態(tài)，F(xiàn)reeman（2000）和 BoleFeysot（1998）等研究表明，PRL不僅間接控制未孕小鼠的導(dǎo)管分支和終末芽的降解，還控制乳腺上皮細(xì)胞促進(jìn)小葉腺泡的發(fā)育。這些結(jié)果也在一定程度上驗(yàn)證了上述結(jié)果，說(shuō)明抑制劑破壞正常乳腺形態(tài)的作用是導(dǎo)致酪蛋白含量下降的另一個(gè)主要原因。此分析也可能從泌乳大鼠的泌乳量和新生仔鼠平均日增重的結(jié)果得到驗(yàn)證。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各試驗(yàn)組之間，LY294002顯著增加了不同時(shí)期母鼠的平均泌乳量，卻顯著降低了試驗(yàn)?zāi)┳惺蟮钠骄赵鲋兀f(shuō)明由于乳腺組織損傷、乳腺中蛋白質(zhì)組成的改變導(dǎo)致乳品質(zhì)的下降，進(jìn)而造成了新生仔鼠平均日增重的顯著降低。

4 結(jié)論

對(duì)于泌乳期某種激素缺乏的情況下，外源激素的添加或許可以提高乳蛋白的合成，但是外源激素和抑制劑對(duì)健康的泌乳期大鼠乳蛋白合成，尤其是酪蛋白的合成反而不利。因此，對(duì)健康的泌乳期動(dòng)物，不建議使用外源激素進(jìn)行干預(yù)。