microRNA-497在麝香保心丸調控急性心肌梗死心室重構中作用機制的實驗研究

黎鎮賜，呂 婧，劉 震，黃建楷，潘藝朝，吳 琪，李 解

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動脈急性缺血缺氧引起的心肌壞死。臨床表現為劇烈而持久的胸骨后疼痛、血清肌鈣蛋白I(troponin I，TnI)、肌紅蛋白(myoglobin，MB)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)等心肌酶活性增高，以及心電圖進行性改變，可累及消化、呼吸、心血管系統，并發心律失常、心臟破裂、心力衰竭、血管栓塞、心源性休克等，危及病人生命[1]。目前，AMI是歐美國家最常見心血管疾病，美國每年有將近150萬人發生心肌梗死。而我國近年來AMI的發病率亦呈明顯上升趨勢，每年新發至少50萬人[1-2]。可見，AMI是我國重要的公共衛生問題，也是臨床急需解決的重要疾病。AMI后心室重構是引起心力衰竭的主要原因。在此過程中，心室的大小、結構以及心臟功能發生變化，主要包括：心肌梗死區膨出，非梗死區心肌肥大、室壁增厚、心肌間質纖維化等表現。目前臨床尚無治愈心力衰竭的方法，因此，探索AMI后心室重構的治療方法成為當務之急[2]。

麝香保心丸具有改善血流動力學、緩解心絞痛、改善心肌缺血等作用，已成功應用于冠心病和AMI等多種心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的治療[3]。microRNA-497(miRNA-497)是一種單鏈非編碼小RNA分子，可參與轉錄后基因表達調控[4]。有研究顯示miRNA-497可能在AMI后心室重構中扮演重要角色[5]。麝香保心丸對AMI后心室重構具有改善作用[6]，但麝香保心丸改善AMI后心室重構的分子學基礎是否為miRNA-497尚不清楚。因此，本研究探討miRNA-497在麝香保心丸改善AMI后心室重構中的作用，以期明確miRNA-497與麝香保心丸改善AMI后心室重構的關系，為AMI后心室重構的治療提供新的選擇，也為后續的藥物開發及新治療方案制定提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SD大鼠75只(SPF級，雄性，體質量300～340 g)，購于上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司[生產許可：SYXK(滬)2018-0041]。75只SD大鼠隨機分為A組、B組、C組、D組、E組，每組15只。

1.2 造模及干預方法 AMI大鼠模型采用結扎左冠狀動脈前降支的方法。實驗操作：腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉溶液(天津蘭洪新能源科技有限公司)麻醉大鼠，剪去胸部被毛并消毒，于胸骨左緣第2肋～第4肋開胸，結扎冠狀動脈左前降支。造模成功的判斷標準：結扎區域變白，且心電圖顯示ST段弓背上抬。A組為空白對照組，僅分離前室間支，不結扎。B組、C組、D組、E組均為造模組。C組尾靜脈注射miRNA-497激動劑(廣州銳博生物有限公司)15 mg/kg，每日1次，連續3 d，灌胃麝香保心丸(上海和黃藥業有限公司)15 mg/kg，每日1次，連續6周；D組尾靜脈注射miRNA-497抑制劑(廣州銳博生物有限公司)15 mg/kg，每日1次，連續3 d，灌胃麝香保心丸(上海和黃藥業有限公司)15 mg/kg，每日1次，連續6周；E組灌胃麝香保心丸(上海和黃藥業有限公司)15 mg/kg，每日1次，連續6周；B組給予等量生理鹽水(上海艾研生物科技有限公司)。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 6周后，觀察大鼠精神狀態、活動頻度、呼吸頻率、捕捉抵抗、毛發狀態、進食量以及是否存活。

1.3.2 心功能指標 麻醉各組大鼠，行右側頸總動脈插管(將連接壓力換能器的插管經右側頸總動脈逆行插入左心室)，通過PowerLab生物信號采集與分析系統(中國香港友誠生物科技有限公司)，測定并記錄左室收縮末壓(left ventricular end systolic pressure，LVESP)、左室內壓最大上升速率(LV+dp/dtmax)、左室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左室內壓最大下降速率(LV-dp/dtmax)。

1.3.3 AMI面積 將各組大鼠處死，摘取心臟，左心室部分稱重后切成1～1.5 mm心肌薄片，將心肌薄片置于1% 2，3，5氯化三苯基四氮唑溶液(北京索萊寶科技有限公司)中，37 ℃避光孵育10 min，用濾紙吸干，稱重，梗死區域呈白色，非梗死區域呈紅色，切下梗死區稱重，AMI面積=(AMI重量/左心室重量)×100%。

1.3.4 大鼠心肌組織形態學變化 取各組大鼠心肌組織，固定，脫水，透明，包埋，切片，脫蠟，脫水，伊紅-蘇木素(eosin-hematoxylin，HE)染色試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)染色，脫水，透明，封片，光學顯微鏡(重慶奧特光學顯微鏡有限公司，型號：MDS400)下觀察心肌組織形態學變化。

1.3.5 心肌細胞凋亡率 取各組大鼠心肌組織，進行原代細胞培養。取第3代心肌細胞，細胞懸液的細胞計數為1×106個，取1支潔凈流式管，依次加入100 μL細胞懸液、5 μL異硫氰酸熒光素(天津希恩思生化科技有限公司)、5 μL碘化丙啶(武漢艾美捷科技有限公司)，充分混勻，25 ℃避光反應15 min，采用流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司，型號：FACSCalibur)檢測心肌細胞凋亡率。

1.3.6 大鼠心肌組織中miRNA-497表達量 提取大鼠心肌組織總RNA，將總RNA逆轉錄成cDNA(Takara公司提供的逆轉錄試劑盒)，本實驗采用ABI 7300 Real-time PCR系統對miR-497基因的表達水平進行相對定量分析。使用的Real-time PCR的上游引物/下游引物均由上海英駿生物技術有限公司提供，以上述cDNA為模板進行PCR擴增，根據擴增曲線讀取循環數(Ct)，將GAPDH作為內參基因，采用相對定量法以2-△△Ct對miRNA-497表達水平進行相對定量分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件進行統計分析，計量資料比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況 A組大鼠精神狀態、飲食活動、毛發生長等均良好，未出現死亡大鼠；B組大鼠呈現病態特征，精神萎靡呈蜷縮狀、活動較少、呼吸淺促、抓起時反抗較輕，毛發枯槁呈黃白色、多見倒豎，進食量明顯減少，4只大鼠死亡；C組大鼠精神狀態、飲食活動、毛發生長等較B組無明顯差異，3只大鼠死亡；D組及E組大鼠精神狀態、飲食活動、毛發生長、抓起時反抗等較B組明顯好轉，各有1只大鼠死亡。

2.2 各組大鼠心肌組織形態學變化 A組大鼠心肌組織排列整齊，橫紋清晰，無變性壞死，未見纖維化，間質無充血腫脹，未見炎性細胞浸潤；B組大鼠心肌組織排列紊亂，橫紋不清，心肌細胞肥大，有大量點狀壞死灶，成纖維細胞大量增生，大量膠原纖維取代心肌細胞，纖維化明顯，間質明顯充血腫脹，炎性細胞浸潤明顯；C組心肌組織病理改變與B組無明顯差異；D組、E組亦出現心肌組織排列略紊亂，橫紋不清，存在點狀壞死，有成纖維細胞增生，部分膠原細胞取代心肌細胞，有纖維化現象，間質腫脹，也出現炎癥細胞浸潤。但總體上，病理改變程度較B組明顯改善，且D組改善較E組更明顯。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態學變化(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠AMI面積和心肌細胞凋亡率比較 與A組比較，B組、C組、D組、E組大鼠AMI面積和心肌細胞凋亡率均明顯升高(P<0.05)；D組、E組大鼠AMI面積和心肌細胞凋亡率均明顯低于B組、C組(P<0.05)，D組大鼠AMI面積和心肌細胞凋亡率均明顯低于E組(P<0.05)；而C組大鼠AMI面積和心肌細胞凋亡率與B組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠AMI面積和心肌細胞凋亡率比較(±s) 單位：%

2.4 各組大鼠心功能指標比較 與A組比較，B組、C組、D組、E組大鼠LVEDP明顯升高(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax明顯降低(P<0.05)；D組、E組大鼠LVEDP明顯低于B組、C組(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax明顯高于B組、C組(P<0.05)；D組大鼠LVEDP明顯低于E組(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax明顯高于E組(P<0.05)；C組大鼠LVEDP、LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax與B組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心功能指標比較(±s)

2.5 各組大鼠心肌組織中miRNA-497表達量比較 與A組比較，B組、C組、D組、E組大鼠心肌組織中miRNA-497表達量均明顯升高(P<0.05)；C組大鼠心肌組織中miRNA-497表達量均明顯高于B組(P<0.05)；D組、E組大鼠心肌組織中miRNA-497表達量明顯低于C組和B組(P<0.05)；D組大鼠心肌組織中miRNA-497表達量明顯低于E組(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中miRNA-497表達量比較(±s)

3 討 論

對于AMI的發病機制，目前國內外均進行了大量的研究，提示該過程為一個多因素、多環節、多靶點的病理過程，而AMI后心室重構是引起心力衰竭的主要原因，AMI后心室重構是指AMI后左心室進行性擴張和外形改變，其機制涉及氧化應激(oxidative stress，OS)、神經內分泌激素激活、腎素-血管緊張素-醛固酮(renin angiotension aldosterone system，RAAS)系統激活、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、炎性細胞因子等。AMI后心室重構已成為心血管領域的研究熱點[7-8]。因此，從病理機制角度探索抑制AMI后心室重構的合理方案具有重要的臨床指導意義。

心室重構在中醫中無相同病名，但就其心悸、頭暈、喘憋、咳嗽、胸悶、胸痛、咯痰、乏力、惡心、腹脹、水腫等心力衰竭癥狀來說，當屬中醫“心悸”“喘證”“胸痹”“水腫”等范疇[9]。麝香保心丸是一種中成藥，由人工麝香、人工牛黃、蟾酥、冰片、蘇合香脂、肉桂、人參提取物組成。麝香保心丸為一種多靶點、多作用途徑的治療藥物，具有擴張冠狀動脈、改善血流動力學、緩解心絞痛、穩定易損斑塊、調節心肌間質膠原表達、縮小梗死心肌面積、抑制血管壁炎性因子、預防心室重構、改善心肌缺血作用。經過多年的臨床實踐，麝香保心丸已應用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)、AMI等心血管疾病的治療，并且被列為全國中醫醫院急診科室首批必備中成藥[10-11]。

本研究從動物實驗的一般情況及心肌細胞凋亡情況可知，麝香保心丸能夠改善AMI后心室重構，這與楊波等[6]的研究結果一致。從傳統中醫理論的角度，心肌梗死后心室重構多見氣虛血瘀，多屬本虛標實，這與麝香保心丸的溫通胸陽、活血化瘀、益氣養心方證相合。

miRNA是近年來分子機制研究領域的熱點。長度為20～25個核苷酸，是一類廣泛存在于真核生物中的單鏈非編碼小分子RNA。miRNA的作用機制主要是通過靶向結合特定mRNA的3′端非編碼區(3′UTR)，促使mRNA降解，抑制mRNA進一步翻譯蛋白，從而對靶基因表達進行轉錄后負調控。前期的研究證實miRNA-497在多種病理過程中表達異常，具有調節細胞增殖、分化、凋亡的作用[12]。miRNA-497可通過負性調節B淋巴細胞瘤/白血病-2(B cell leukemia-2，Bcl-2)而發揮促進缺血性神經元凋亡的作用[13]。在缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)過程中，miRNA-497異常表達[14]。在AMI大鼠心臟中，miRNA-497表達明顯上調，如果下調miRNA-497水平，可縮小AMI大鼠心肌梗死面積和減少心肌細胞凋亡，增強自噬(autophagy)流[15]。本研究亦發現下調miRNA表達可抑制細胞凋亡，C組大鼠一般情況、心肌組織病理學改變、LVEDP、LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax、AMI面積、心肌細胞凋亡率較B組無明顯改善，D組及E組大鼠一般情況、心肌組織病理學改變、LVEDP、LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax、AMI面積、心肌細胞凋亡率較B組有明顯改善，且D組較E組改善更明顯，提示miRNA-497是麝香保心丸改善AMI后心室重構中的關鍵分子，miRNA-497能夠介導麝香保心丸改善大鼠AMI后心室重構。

綜上所述，miRNA-497是麝香保心丸改善AMI后心室重構中的關鍵分子，這為AMI后心室重構提供了新的研究方向。