外源AHLs信號分子對假單胞菌(Pseudomonas)致腐能力的影響

張玉華，孟一，王順意，陳東杰

1(山東商業職業技術學院,國家農產品現代物流工程技術研究中心,山東 濟南， 250103)2(山東農業工程學院，山東 濟南， 250100)

EffectofexogenousAHLssignalmoleculesonthespoilageabilityofPseudomonas

ZHANG Yuhua1*,MENG Yi1,WANG Shunyi2,CHEN Dongjie1

1(Shandong Institute of Commerce and Technology National Engineering Research Center for Agricultural Products Logistics， Jinan 250103, China)2(Shandong Agriculture and Engineering University, Jinan 250100, China)

ABSTRACTIn order to explore the quorum sensing (QS) ofPseudomonasand its effect on meat spoilage, exogenous acylhomoserine lactone (AHLs) -like signal molecules were added to the culture medium ofPseudomonasto measure the growth curves and biofilm change. Sterile pork chunks were treated withPseudomonassolution supplemented with AHLs. Sensory evaluation was carried out during storage. Total volatile basic nitrogen (TVB-N) was measured. Volatile organic compounds were analyzed by gas chromatography-ion mobility spectrometry (GC-IMS). The results showed that the four signal molecules,N-hexanoyl-L-homoserine lactone(C6-HSL),N-octanoyl-L-homoserine lactone(C8-HSL),N-dodecanoyl-L-homoserine lactone (C12-HSL) andN-tetradecanoyl-L-homoserine lactone(C14-HSL) had no obvious influence on the growth ofPseudomonas(P>0.05), but they could promote the formation of biofilm(P<0.05), of which C8-HSL and C12-HSL had the most significant influence. At the later stage of pork storage, sensory score in the group with exogenous AHLs signal molecules was significantly lower than that in the control group (P<0.05), and theTVB-N value was higher (P<0.05). The volatile organic compounds produced by adding exogenous AHLs signal molecules were different from the fresh group and the control group, and the volatiles produced were also different when adding different signal molecules. The C14-HSL group had the highest similarity with the control group, while the C6-HSL group had the lowest similarity with the control group and the fresh group. This study showed that exogenous signal molecules have no effects on the growth ofPseudomonas. However, they could promote the spoilage ability ofPseudomonas, and the effects of different signal molecules were different.

Keywordsacylhomoserine lactone(AHLs);signaling molecule;quorum sensing;Pseudomonas； spoilage ability

大量研究表明，食品腐敗菌的致腐性受群體感應(quorum sensing，QS)系統的調控，腐敗菌的作用與QS密不可分[1-2]。QS是微生物之間的信息交流傳遞機制[3]，當細菌空間數量達到一定密度時，能夠自發地產生并釋放信號分子，當信號分子濃度達到閾值濃度時，細菌就會啟動相關基因的表達，從而調控某些生物行為[4]，如生物發光、毒性因子分泌、孢子產生、生物膜形成和抗生素合成等[5-6]。肉的腐敗變質主要是由分解蛋白質、脂肪的特定腐敗菌(specific spoilage organism, SSO)引起的，在有氧條件下，假單胞菌(Pseudomonas)是冷卻肉主要的SSO[7-8]。因此，研究肉中假單胞菌的QS現象并進行調控，可以控制肉的腐敗進程，對于靶向抑菌及保障肉品質量安全具有重要意義[9]。假單胞菌的QS系統主要是酰基高絲氨酸內酯(acylhomoserine lactone, AHLs)系統，其信號分子為不同長度的AHLs類化合物[10]。

國內外研究者針對肉類腐敗過程中信號分子的種類及其作用開展了廣泛的研究[3]，但在外源信號分子對假單胞菌生長繁殖及對肉品質的影響方面的研究較缺乏。本文研究了4種不同外源信號分子N-己基-L-高絲氨酸內酯(N-hexanoyl-L-homoserine lactone,C6-HSL)、N-辛酰-L-高絲氨酸內酯(N-octanoyl-L-homoserine lactone，C8-HSL)、N-十二烷基-L-高絲氨酸內酯(N-dodecanoyl-L-homoserine lactone,C12-HSL)、N-十四烷基-L-高絲氨酸內酯(N-tetradecanoyl-L-homoserine lactone,C14-HSL)對假單胞菌生長的影響，通過測定冷卻豬肉貯藏過程中感官、揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)以及揮發性有機物等指標，探究在外源AHLs信號分子誘導下假單胞菌對冷卻豬肉致腐能力的影響，為進一步明確QS在肉品腐敗中的作用，以及基于干擾腐敗菌QS的冷卻肉防腐保鮮提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻豬肉為豬里脊肉，雙匯冷鮮肉專賣店；假單胞菌(Pseudomonas)ACCC 01056，中國農業微生物菌種保藏中心；純度>98%AHLs標準品(C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL)，Sigma公司；蛋白胨、牛肉膏、瓊脂等，北京奧博星生物技術有限責任公司；MgO、硼酸等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T9S紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；SCIENTZ-04無菌均質器，寧波新芝生物科技股份有限公司；BHC-1300生物安全柜，江蘇通凈凈化設備有限公司；HZL-280恒溫振蕩培養箱，太倉市強樂實驗設備有限公司；K9840凱氏自動定氮儀，濟南海能儀器有限公司；FlavourSpec 1H1-00053氣相色譜離子遷移譜，德國 G.A.S.公司；CTC-PAL自動進樣裝置，瑞士 CTC Analytics AG 公司；毛細管柱(30 mm×0.25 mm×0.50 μm，CLOT)，德國 CS Chromatographie Service GmbH 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株生長曲線的繪制

根據張笑笑[11]的方法加以修改。準備1 000 mL滅菌肉湯培養基，接種10環假單胞菌，制成菌懸液，菌懸液的OD600值約為0.07。將菌懸液分成5等份于滅菌錐形瓶中，28 ℃振蕩培養2 h后，分別加入過濾除菌的信號分子C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL溶液，使信號分子最終濃度約為10 μmol/L，用無菌蒸餾水代替信號分子溶液加入肉湯培養基作為對照。每隔2 h測吸光值OD600，連續測量24 h，每個處理做5次平行。以培養時間為橫坐標，以OD600數值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.2 假單胞菌生物膜的測定

采用結晶紫染色法[12]進行測定，根據洗脫液的吸光值對生物膜進行定量分析。準備100 mL滅菌肉湯培養基，接種1環假單胞菌，混合均勻，制成菌懸液。取5 mL菌懸液于滅菌試管中，靜置培養過夜后，分別加入信號分子C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL，使信號分子的最終濃度為10 μmol/L，對照組加入相同體積的無菌水。28 ℃培養24 h，培養完成后，向試管內加入1 mL質量濃度為1 g/L結晶紫染色劑染色15 min。然后用1 mL的雙蒸水沖洗，再加入5 mL 95%(體積分數)乙醇溶液進行漂洗，測定漂洗液在570 nm吸光值，每個處理進行3次平行試驗。

1.3.3 無菌豬肉的處理與接種

根據朱素芹[13]的方法加以修改。在無菌條件下，將新鮮豬肉切成約(8×3×6) cm的肉塊，然后用75%(體積分數)酒精浸泡1 min，再用無菌生理鹽水清洗3次，最后在生物安全柜中用紫外燈照射1 h，得到表面無菌豬肉。

取10環假單胞菌置于1 000 mL無菌生理鹽水中，將菌液分成5份，取其中4份分別加入信號分子C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL，使信號分子的最終濃度為10 μmol/L，第5份加入相同體積的無菌水作為對照。將無菌肉塊在菌液中浸泡10 s后裝入無菌封口均質袋中，置4 ℃恒溫箱中貯藏，以接種假單胞菌但無信號分子的肉塊為對照組，貯藏期間每2 d取樣測定。

1.3.4 感官評價

感官評價標準在參考GB/T 22210—2008[14]和GB/T 9959.2—2008[15]的基礎上加以修改。由15名經訓練的品評員組成感官評價小組，根據色澤、氣味、彈性、組織形態進行鮮度評價，評價標準如表1所示。采用5分法進行評分，4～5分為一級鮮度肉；3～4分為二級鮮度肉；3分為可接受界限，即感官拒絕點；1～3分為腐敗肉。

表1 冷卻豬肉品質感官評價表Table 1 Sensory evaluation of chilled pork

1.3.5 揮發性鹽基氮的檢測

按照國標GB 5009.228—2016[16]規定的方法進行測定。取20 g切碎的肉樣加入100 mL去離子水中，振搖，浸漬30 min后過濾，取10 mL濾液用半微量定氮法測定3次，取平均值。同時做試劑空白。

1.3.6 揮發性有機物檢測

將1.3.3處理的樣品肉在貨架終點時進行氣相離子遷移譜(gas chromatography-ionmobility spectrometry，GC-IMS)檢測，同時測定新鮮樣品的揮發性有機物。測定條件如下:

(1)頂空進樣條件

頂空孵化溫度：45 ℃；孵化時間：10 min；加熱方式：振蕩加熱；頂空進樣針溫度：50 ℃；進樣量：500.0 μL，不分流模式；利用高純N2(純度≥99.999%)推進和清洗進樣針，清洗時間：0.5 min。

(2)GC- IMS 條件

色譜柱溫度：40 ℃；運行時間：15 min；載氣：高純N2(純度≥99.999%)；流速：初始 5 mL/min，保持10 min后于5 min內線性增至150 mL/min。漂移管長度：5 cm；管內線性電壓：400 V/cm；漂移管溫度：40 ℃；漂移氣：高純N2(純度≥99.999%)；流速：150 mL/min；IMS探測器溫度：45 ℃。

(3)檢測方法

取3.0 g樣品，置于20 mL進樣瓶中，45 ℃孵化10 min，頂空進樣，用FlavourSpec?風味分析儀進行檢測，采用G.A.S公司開發的軟件分析給出樣品中揮發性有機物的差異譜圖，并利用軟件內置的NIST數據庫和IMS數據庫對物質進行定性分析。

1.3.7 數據處理

采用 SPSS 23.0 軟件進行數據分析，結果均采用平均值±標準差來表示，設定P<0.05 為差異顯著，P<0.001為差異極顯著，用 Origin 9.1 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源AHLs信號分子對假單胞菌生長曲線的影響

添加外源信號分子與對照組的假單胞菌生長曲線如圖1所示。各處理組的假單胞菌生長呈典型的S型曲線，前期增長平緩，中期急劇生長，后期又趨于緩慢增長的狀態，逐漸達到平穩。實驗組與對照組假單胞菌數無顯著區別(P>0.05)，添加4種外源AHLs信號分子對假單胞菌生長均未產生明顯的影響。

圖1 添加外源信號分子AHLs后各組假單胞菌生長曲線Fig.1 Growth curves of Pseudomonas in each group added exogenous signal molecules AHLs注：C6、C8、C12、C14分別表示添加C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL組(下同)

2.2 外源AHLs信號分子對假單胞菌生物膜形成的影響

微生物形成的生物膜黏附于物體表面且難以清除，可以抵抗逆性環境，增強自身對抗生素、環境及宿主免疫系統的耐受能力，是導致腐敗菌持續污染食品的重要因素之一[6]。研究發現，假單胞菌的成膜過程受QS系統的調控[17]。

圖2 各處理組假單胞菌生物膜的形成Fig.2 Formation of Pseudomonas biofilm in each group

圖2為添加信號分子組與對照組培養24 h后測得的吸光值OD570，添加信號分子的4組吸光值OD570均明顯高于對照組，其中C8-HSL和C12-HSL兩組達到極顯著差異(P<0.01)。由此推斷，外源信號分子C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL提高了假單胞菌生物被膜的形成能力。

2.3 外源AHLs信號分子對冷卻豬肉揮發性鹽基氮的影響

TVB-N是動物類蛋白質在腐敗過程中由細菌和酶作用產生的氨以及胺類等堿性含氮物質，其含量多少是評價肉類新鮮程度的重要指標。根據國標GB 2707—2016規定[18]，新鮮豬肉TVB-N≤15 mg/100g，貯藏前期各組TVB-N呈平緩上升狀態，在第8～10天時達到15 mg/100g左右，此后TVB-N值上升速度加快。在貯藏前10 d，實驗各組TVB-N值與對照組無明顯差異(P>0.05)，第12、14、18、20天時，實驗各組的TVB-N值顯著高于對照組(P<0.05)。

圖3 冷卻豬肉貯藏過程TVB-N變化曲線Fig.3 TVB-N curves of chilling pork during storage

2.4 外源信號分子AHLs對冷卻豬肉感官評價的影響

冷卻豬肉貯藏過程中，實驗組與對照組感官評分如圖4所示。隨貯藏時間延長，感官評分下降。第0～10天，實驗組與對照組感官評分無顯著差異(P>0.05)；第10天后，實驗各組顯著低于對照組(P<0.05)，而4個實驗組之間無明顯異(P>0.05)。原因可能是當假單胞菌達到一定數量時，外源信號分子對假單胞菌的誘導作用使肉的腐敗進程加速。

2.5 外源信號分子AHLs對冷卻豬肉中揮發性有機物的影響

2.5.1 揮發性有機物差異

圖中深色為背景色，淺色表示揮發性有機物，顏色深淺與揮發性有機物濃度有關，淺色表示該有機物濃度較低，深色表示濃度較高(圖5-a)，可見不同處理組樣品之間的揮發性有機物存在差異。為了更直觀地顯示不同實驗組間的差異，采用差異對比模式(圖5-b)，選取新鮮組作為參比，其他各組的譜圖扣減參比。如二者揮發性成分一致，則扣減后的背景為白色，其他顏色為二者差異，其中紅色代表該物質的濃度高于參比，藍色代表該物質的濃度低于參比。由圖5可知，部分揮發性有機物在貯藏肉組中的含量比新鮮肉組低(藍色區域點)，而部分揮發性有機物在貯藏肉組中的含量遠高于新鮮肉組(紅色區域點)，其中有些揮發性有機物在C6-HSL組中的含量最高(如藍色圓圈標出)。說明各處理組冷卻豬肉經貯藏后揮發性有機物種類和數量發生了明顯的變化。

a-原始圖;b-差異對比圖圖5 不同處理樣品的揮發性有機物Fig.5 Volatile organic compounds in different samples注：XX表示新鮮組，DZ表示對照組，數字表示每個樣品平行測定次數(下同)

2.5.2 揮發性有機物指紋圖譜對比

圖中每一行代表一個樣品的全部信號峰，每一列代表同一揮發物在不同樣品中的信號峰，由圖6可知，每個樣品的完整揮發物信息以及樣品之間揮發物的差異。在新鮮豬肉樣品中以下幾種物質含量較高：乙酸單體(acetic acid monomer)、2-乙基呋喃(2-ethylfuran)、1-戊醇(1-pentanol)、丙酸(propanoic acid)、2-甲基丙醇(2-methylpropanol)、3-甲基-3-丁烯-1-醇(3-methyl-3-buten-1-ol)、2-丙醇二聚體(2-propanol dimer)、2-甲基丙酸(2-methylpropanoic acid)、3-戊酮(3-pentanone)、丙酮醇(hydroxyacetone)、乙酸二聚體(acetic acid dimer)、3-甲基丁酸(3-methylbutanoic acid)、異己醇(isohexanol)、乙酸己酯(hexyl acetate)、戊酸(pentanoic acid)、1-辛烯-3-酮(1-octen-3-one)、3-甲基丁醛(3-methylbutanal)、1-戊醇(1-pentanol)、2,3-丁二醇(2,3-butanedione)等，而在實驗組和對照組中含量極低，由此推斷，這些物質決定了新鮮豬肉特有的風味。

在實驗組C6-HSL中，丁酸(butanoic acid)、庚醛(heptanal)、乙酸丁酯(butyl acetate)、2-甲基吡嗪(2-methylpyrazine)、糠醛(furfural)等含量較高，但這些成分在新鮮豬肉中幾乎不存在，在對照組及C8-HSL、C12-HSL和C14-HSL中含量較低。因此，該類物質是C6-HSL組區別于其他幾組的主要成分。

圖6 豬肉揮發性有機物指紋圖譜Fig.6 Fingerprint of volatile organic compounds in pork

2-乙酰呋喃(2-acetylfuran)、苯甲醇(benzyl alcohol)、苯乙醛(phenylacetaldehyde)和乙酸乙酯(ethyl acetate)等在對照組和C14-HSL中含量較高；糠醇(furfural alcohol)、芳樟醇(linalool)、1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)、2-甲基-1-丁醇(2-methyl-1-butanol)等在C8-HSL中含量最高，而在對照組和其他實驗組中的含量較低；甲基異丁基酮(methyl isobutyl ketone)在C14-HSL中含量最高。上述成分在新鮮樣品中幾乎不存在。

2.5.3 不同樣品揮發物的相似度分析

對不同樣品間揮發性有機物的整體相似程度進行分析，如圖7和表2所示，同一樣品2次平行測定結果的相似度達85%以上，說明儀器的重復性良好。新鮮組與對照組和4個實驗組的相似度均較低，為41%～52%，說明冷卻豬肉經貯藏后揮發性成分較新鮮肉發生了較大變化。其中，新鮮組與C6-HSL組的相似度最低，為41%～45%。4個實驗組C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL中，C14-HSL組與對照組的相似度最高，為75%～84%；C6-HSL組與對照組的相似度最低，為57%～67%。由此推斷，添加外源信號分子C6-HSL組冷卻豬肉經一段時間貯藏后，其揮發性成分發生了顯著的變化。

圖7 各處理組樣品揮發性有機物的匹配矩陣Fig.7 Matching matrix of volatile organic compounds in each group

2.5.4 不同實驗組樣品的聚類分析

對各處理組樣品揮發性有機物進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，很明顯地分為兩類：一類是新鮮組，另一類包括對照組和4個實驗組，可見新鮮組與對照組、實驗組的差異非常大。在對照組與實驗組類別中，對照組與C14-HSL組的差異最小，與C6-HSL組的差異最大(圖8)。

表2 各處理組樣品揮發性有機物的相似度Table 2 Similarity of volatile organic compounds in each group

圖8 各處理組樣品主成分分析Fig.8 PCA of samples in each group

3 結論與討論

添加4種外源信號分子C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL后假單胞菌的生長曲線與對照組無差異(P>0.05)，說明信號分子對假單胞菌的生長繁殖不起作用，這與張笑笑[12]的研究結果一致。外源AHLs信號分子能夠促進假單胞菌生物被膜的形成，其中C8-HSL與C12-HSL的影響最顯著。張笑笑[12]研究發現，不同的AHLs信號分子對S.baltica100菌株生物被膜形成能力影響不同，C10-HSL顯著増強了S.baltica100菌株生物被膜的形成能力。YANG等[19]研究發現添加外源C10-HSL、oxo-C10-HSL、OH-C10-HSL促進了Cylindrothecasp.生物被膜的形成，其中C10-HSL的影響最為顯著。

在貯藏前期，添加外源AHLs信號分子對冷卻豬肉TVB-N和感官評價無顯著影響(P>0.05)，而在貯藏后期，外源AHLs信號分子促進TVB-N的生成，并加速感官品質的降低。張笑笑[11]研究發現，外源AHLs信號分子的添加加速了無菌魚汁的腐敗，TVB-N的生成量增加。ZHU等[20]研究凡納濱對蝦也得到了相似的實驗結果。

冷卻豬肉添加外源AHLs信號分子組與新鮮組、對照組揮發性有機物存在差異，添加不同AHLs信號分子組之間揮發物也存在差異。相似度分析與聚類分析結果均表明，C14-HSL組與對照組的相似度最高，C6-HSL組與對照組和新鮮組的相似度均最低。

以上結果表明，外源AHLs信號分子對假單胞菌株自身的生長繁殖無影響，但能促進其對冷卻豬肉的致腐能力，且不同信號分子的促進作用存在差異。原因可能與該菌株自身產生的信號分子結構有關，后期將對該菌株產生的信號分子種類和結構進行深入研究。