19 號染色體開放閱讀框5 蛋白調節自噬活性與結直腸癌惡性程度的關系△

李勝龍，閆炳文，王春敬，王明宇，喬鵬飛，王夫景#

1哈爾濱醫科大學附屬第二醫院普通外科，哈爾濱150086

2哈爾濱醫科大學附屬第一醫院普通外科，哈爾濱1500000

結直腸癌是中國常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來中國結直腸癌的發病率和病死率均呈逐年升高的趨勢，嚴重威脅著人們的健康。19 號染色體開放閱讀框5（chromosome 19 open reading frame 5，C19ORF5）也稱微管相關蛋白1S（microtubule associated protein 1S，MAP1S），是微管相關蛋白1 家族的一員，在細胞分裂中的功能已被證實，其在細胞分裂的起始階段具有關鍵作用[1]。自噬現象是細胞通過溶酶體清除有缺陷的線粒體和蛋白質聚合體，從而維持線粒體自身穩定性，緩解內質網的應激狀態[2]。自噬發生在真核細胞中，是細胞初級溶酶體處理內源性底物的重要過程，自噬功能障礙可誘導氧化應激，削弱有絲分裂檢查點，引起DNA 雙螺旋鏈裂解。這一系列的變化最終會導致遺傳不穩定性的產生，是大多數實體瘤的起源。C19ORF5 是一種適配器蛋白，能夠正向調控自噬活性，參與自噬溶酶體的產生和降解，從而影響基因的不穩定性和腫瘤的發生[3-7]。C19ORF5 升高時可激活自噬活性，抑制氧化應激反應和基因的不穩定性，而C19ORF5 缺乏時，自噬活性降低，基因不穩定性增加，易誘導腫瘤發生，因此認為C19ORF5 調節自噬活性與腫瘤病灶的惡性程度呈負相關[4]。因此，本研究探討了C19ORF5 調節自噬活性與結直腸癌惡性程度的關系，旨在為結直腸癌化療藥物的開發、應用提供理論基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013 年5 月至2017 年5 月于哈爾濱醫科大學附屬第二醫院接受治療的結直腸癌患者。納入標準：①經術后病理明確診斷為原發性結直腸癌；②術中完整切除腫瘤，病理證實切緣陰性；③術前無新輔助治療，如化療、放療等；④臨床資料、病理資料及隨訪資料完整。排除標準：①既往有腫瘤病史；②合并嚴重的心、腦、肺等基礎疾病；③手術未達到R0切除。依據納入和排除標準，本研究共納入141 例結直腸癌患者。其中，男92 例，女49 例；年齡45～75 歲，中位年齡為63 歲；腫瘤類型：直腸癌94 例，升結腸癌14 例，橫結腸癌7 例，降結腸癌5 例，乙狀結腸癌21 例；TNM 分期：Ⅰ期6 例，Ⅱ期24例，Ⅲ期74例，Ⅳ期37例；病理類型：管狀腺癌116 例，黏液腺癌20 例，未分化癌3 例，神經內分泌癌2例。收集結直腸癌患者的結直腸癌組織和癌旁正常組織（距結直腸癌組織≥5 cm）各141例。

1.2 檢測方法

將結直腸癌組織和癌旁正常組織切分為3 個部分。第一部分觀察組織中線粒體和溶酶體/自噬體超微結構的變化，首先應用枸櫞酸鈉洗滌3 次，2.5%的戊二醛固定，4 ℃冷藏3 h，然后制作成超薄切片并染色，在高壓（80 kV）透射電鏡下觀察超微結構的變化。將第二部分組織置于4%多聚甲醛溶液中，將其固定、兩次脫水處理、包埋，趁其未凝固，將組織蠟塊切成5 μm 厚的薄片，切片貼于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，68 ℃烤片后，在顯微鏡下進行免疫組織化學染色。第三部分組織進行實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），采用實時定量PCR 試劑盒檢測組織中C19ORF5 mRNA 的表達水平。

1.3 結果判定

細胞質或細胞核中出現棕黃色顆粒為陽性細胞。隨機觀察5 個高倍視野，采用半定量法進行評分。依據染色強度評分：無色為0 分，淡黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。依據陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞百分比﹤25%為1 分，25%～75%為2 分，﹥75%為3 分。染色強度評分與陽性細胞百分比評分相加，0～3 分為低表達，4～6 分為高表達。

1.4 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織和癌旁正常組織中C19ORF5蛋白表達情況的比較

電鏡下觀察組織的超微結構，尤其是亞細胞器官（線粒體和溶酶體/自噬體）的結構。結果顯示，Ⅰ/Ⅱ期結直腸癌細胞的自噬活性較高，Ⅲ/Ⅳ期結直腸癌細胞的自噬活性較低。免疫組織化學染色結果顯示，C19ORF5 蛋白為淡黃色至棕褐色顆粒，表達于細胞質。結直腸癌組織中C19ORF5 蛋白的染色強度明顯高于癌旁正常組織，Ⅰ/Ⅱ期結直腸癌組織中C19ORF5 蛋白的染色強度明顯高于Ⅲ/Ⅳ期結直腸癌組織（圖1）。

2.2 結直腸癌組織和癌旁正常組織中C19ORF5 mRNA 表達水平的比較

結直腸癌組織中C19ORF5 mRNA 的表達水平為（1.17±0.45），明顯高于癌旁正常組織的（0.82±0.29），差異有統計學意義（t=3.217，P=0.004）。

2.3 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中C19ORF5 蛋白表達情況的比較

結直腸癌組織中C19ORF5 蛋白低表達97 例，C19ORF5 蛋白高表達44 例。TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）升高、無肝轉移結直腸癌患者結直腸癌組織中C19ORF5 蛋白高表達率分別高于TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、CEA 正常、有肝轉移的患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。不同淋巴結轉移情況結直腸癌患者結直腸癌組織中C19ORF5 蛋白表達情況比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）。（表1）

圖1 C19ORF5蛋白在結直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達情況（免疫組織化學染色，×400）

3 討論

結直腸癌是嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，據報道，全球每年新增結直腸癌患者102萬例，死亡53 萬例[8]。手術或聯合放化療可改善結直腸癌患者的預后，但遠期生存情況的改善不明顯。隨著基礎研究的不斷發展，靶向治療及免疫治療已逐漸成為惡性腫瘤輔助治療的重要方法，研究與發現新的結直腸癌標志物對改善臨床治療效果、延長患者的生存時間具有重要意義。C19ORF5 是作用于自噬過程的一種適配器蛋白，能夠正向調控自噬活性，并參與自噬溶酶體的產生和降解[9-10]。自噬功能障礙可誘導氧化應激，氧化應激可削弱有絲分裂檢查點，引起DNA 雙螺旋鏈裂解。這一系列的變化最終會導致遺傳不穩定性的增加，是大多數實體瘤的起源，并對腫瘤的發生發展具有調節作用，已成為研究熱點[11]。

本研究結果顯示，Ⅰ/Ⅱ期結直腸癌組織中C19ORF5 蛋白的染色強度明顯高于Ⅲ/Ⅳ期結直腸癌組織，說明C19ORF5 蛋白在早期結直腸癌組織中高表達，自噬過程較為活躍，在晚期結直腸癌組織中表達降低，自噬活性降低。研究發現，C19ORF5 蛋白可增強自噬作用，其與氧化應激和基因不穩定性之間具有重要關聯[4]。高水平的氧化應激和基因的不穩定性均能夠增強C19ORF5 蛋白的表達，而C19ORF5 蛋白可激活自噬作用，去除p62（一種反映細胞氧化應激強度的自噬底物蛋白）相關的聚合體與失去功能的細胞器，從而抑制氧化應激過程，減少DNA 雙螺旋的裂解，并抑制基因的不穩定性。由于存在著這樣的反饋環路，機體才能夠保持平衡和穩定的發展。一旦C19ORF5蛋白表達缺失，自噬活性將受到影響，反饋環路被打破，基因的不穩定性將會增加[4,12-13]。因此，C19ORF5 蛋白增強自噬作用與抑制基因的不穩定性和腫瘤發生的關系得以建立。

表1 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中C19ORF5 蛋白表達情況的比較（n=141）

本研究的實時定量PCR 結果顯示，結直腸癌組織中C19ORF5 mRNA 的表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P﹤0.01）；TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、CEA 升高、無肝轉移結直腸癌患者結直腸癌組織中C19ORF5 蛋白高表達率分別高于TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、CEA 正常、有肝轉移的患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。說明結直腸癌組織中C19ORF5 mRNA 表達水平升高，且其蛋白表達情況與TNM 分期、CEA 水平、肝轉移有關。有研究顯示，C19ORF5 蛋白主要表達于復層上皮細胞的細胞質中，隨著腫瘤細胞的增殖，表達C19ORF5 蛋白的細胞數量增多[11,14]。腫瘤發生后，為滿足機體對自噬活性的需求，C19ORF5 蛋白會在腫瘤生發中心表達上調，但如果C19ORF5 蛋白在腫瘤細胞中缺失，自噬活性將降低，低表達C19ORF5 蛋白的患者生存率降低，且患者易出現淋巴結和肝轉移等[15]。

綜上所述，在結直腸癌組織中，高表達的C19ORF5 蛋白可增加腫瘤細胞的自噬活性，增加基因的穩定性，降低腫瘤的惡性程度。因此推測，由于C19ORF5 蛋白調節自噬活性與結直腸癌的惡性程度呈負相關，C19ORF5 可能是一種重要的抑癌基因，C19ORF5 蛋白缺失或基因變異可能是導致腫瘤進一步惡化的關鍵因素。針對C19ORF5 蛋白的深入研究可以為結直腸癌的診斷和治療提供新的思路。