不同噴霧干燥入口溫度下雞蛋清差異蛋白質組學分析

劉麗莉 史勝娟 陳 珂 張孟軍 郝威銘 李媛媛

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023;2. 食品加工與安全國家級教學示范中心，河南 洛陽 471023)

雞蛋清蛋白質的氨基酸組成與人體的十分接近，是理想的蛋白質來源[1]。雞蛋清中富含鐵、鈣、鋅、鉀和磷等，是對人體健康起關鍵作用的礦物質。另外，因為雞蛋清蛋白占干物質的80%以上[2]，具有優(yōu)異的發(fā)泡和凝膠性能等多種功能特性[3]，常被作為制作烘焙產品、蛋白和肉制品的原材料應用于食品加工中。

噴霧干燥是指通過將樣品噴入一種熱的干燥介質中，熱空氣與液滴迅速接觸，水分瞬間蒸發(fā)，從而可以快速得到脫水產品。由于粉末材料的固有特性，如減少包裝、貯藏和運輸費用，將噴霧干燥作為一種重要的技術納入蛋清蛋白的生產過程是非常重要的。此外，其干燥接觸時間相對較短(5～100 s)[4]。非標記定量(iTRAQ)技術具有重復性高，定量較好等優(yōu)勢。Raikos等[5]將2-DE結合質譜鑒定的蛋白質組學方法應用于雞蛋蛋白的分離和鑒定中，成功鑒定出簇蛋白(clusterin)、卵轉鐵蛋白(ovotransferrin)、卵白蛋白(ovalbumin)、thetical protein FIJ 10305和activin receptor type IIA 5種蛋白。Guérin-Dubiard等[6]采用2-DE和質譜連用技術，鑒定出16種蛋白，其中Tenp和VMO-1兩種蛋白首次被發(fā)現，其他的蛋白分別是卵糖蛋白(ovoglycoprotein，又稱alpha 1-acid glycoprotein)、卵白蛋白、卵白蛋白X(ovalbumin-related protein X，OVAX)、卵轉鐵蛋白、TENP(transiently expressed in neural precursors)及溶菌酶C。Omana等[7]運用組學的方法研究了雞蛋在貯藏過程中蛋清蛋白質組的差異。

蛋白質組學是高通量研究蛋白質組最常用的方法，被廣泛應用于多個學科。目前，關于蛋清粉在不同噴霧干燥入口溫度下差異蛋白質組學的研究尚未見報道。試驗擬以干燥入口溫度140，160，180 ℃的蛋清粉為研究對象，采用iTRAQ技術構建蛋清蛋白在干燥過程中的表達圖譜，分析三者間的差異蛋白質組學變化[8]，旨在更好地了解并篩選出雞蛋清不同干燥溫度過程中影響較大的功能蛋白，為解釋噴霧干燥加工雞蛋清的加工方式和生物功能性質等提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雞蛋：河南洛陽大商新瑪特超市；

蛋清粉：自制，將蛋白、蛋黃分開，自然發(fā)酵(脫去葡萄糖，使蛋清具有更好的起泡和凝膠性)，60 ℃巴氏殺菌處理4 min，再進行噴霧干燥處理，并于4 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

Modified Trypsin蛋白酶：質譜級，美國PROMEGA公司；

NUPAGE 10% BT GEL 1.0MM 12W、Protease Inhibitor Cocktail、Bond-BreakerTMTCEP Solution (TCEP)、PierceTMBCA Protein Assay Kit：美國Thermo Fisher Scientific公司；

iTRAQ 8PLEX、AB SCIEX、IAM碘乙酰胺、氨水：美國Sigma公司；

恒溫混勻儀：TMR型，合肥艾本森科學儀器有限公司；

酶標儀：Varioskan LUX型，賽默飛世爾科技公司；

Q-液相色譜—質譜聯用儀：Q-Exactive HF-X型，賽默飛世爾科技公司；

色譜柱：IMAC型，伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司；

電泳儀：1645052型，伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司。

1.2 凝膠電泳的測定

根據Katekhong等[9]的方法。將樣品與緩沖液混合，煮沸4 min，2 700 r/min離心10 min，將含有20 μg蛋白質的每個樣品溶液10 μL裝入單獨的孔中，于恒定電壓(150 V)下電泳45 min，最后將其降解2.5 h。

1.3 iTRAQ技術測定

1.3.1 樣品處理 將制備好的蛋清粉樣品(每個樣品4 μL，共12 μL蛋清)進行混合并稀釋至12 μL PBS中，用112 μL 98%乙醇沉淀，用胰蛋白酶(即1/50，胰蛋白酶/蛋白質)切割，37 ℃下過夜。

1.3.2 質譜分析 用納米反相柱洗脫肽陽離子。通過電噴霧電離將洗脫的肽陽離子轉化為氣相離子，并在熱軌道聚變質譜儀上進行分析[10]。在120 k分辨率(m/z200)下，用5×105離子計數靶對m/z400～1 600的肽前體進行測量掃描。串聯MS/MS在第1.5天與四極桿分離。動態(tài)排斥持續(xù)時間設置為45 s。開啟單同位素前體選擇，儀器以最高速度運行，循環(huán)時間為2 s。

1.3.3 蛋白質組數據分析 所有數據均采用Max Quant Software Reversion 1.5.3.8進行收集和量化。對于蛋白質分類，使用在線PANTHER庫。為了在蛋清蛋白中發(fā)現過度表達的基因本體論(GOs)，啟動PANTHER過度表達試驗，用Bonferroni校正對G.gallus(數據庫中的所有基因)參考列表和注釋數據集進行多次試驗，完成GO分子功能和GO生物過程。

1.3.4 統(tǒng)計分析 分析前，使用自然對數轉換[ylg(x+1)]轉換蛋白質組數據[11]。首先，對蛋白質組數據集進行組間成分分析(BGA)。BGA通過對組均值進行主成分分析來關注組間變異性。組間差異的重要性由組間慣性與總慣性之比進行評估。使用蒙特卡羅排列試驗檢查組間差異的統(tǒng)計顯著性。用Monte Carlo排列試驗評價統(tǒng)計學意義。CIA可以應用于變量數遠遠超過樣本數的數據集。

2 結果與分析

2.1 噴霧干燥入口溫度對蛋清蛋白SDS-PAGE的影響

由圖1可知，經不同噴霧干燥溫度制得的蛋清粉的蛋白條帶分布大體相似，且蛋白質組分變化較小。25～30 kD范圍內，25 kDa處對應的是卵類黏蛋白，但條帶A、B、C均沒有卵類黏蛋白條帶，可能是由于蛋清液在噴霧干燥前加水稀釋處理或在噴霧干燥過程中，卵黏蛋白等聚集物被除去，所以在電泳圖上并沒有卵類黏蛋白的特征條帶。條帶A、B、C中并沒有新的分子量蛋白質生成，說明蛋白質的一級結構沒有因為干燥溫度的變化而發(fā)生改變。采用SDS-PAGE對蛋清蛋白進行質檢，發(fā)現蛋清蛋白條帶清晰、無雜質，符合后續(xù)試驗要求。

M. Marker A. 140 ℃ B. 160 ℃ C. 180 ℃圖1 3種蛋清粉的SDS-PAGE圖Figure 1 SDS-PAGE of three kinds of egg white powder

2.2 差異表達蛋白質的鑒定及統(tǒng)計分析

由表1可知，試驗中共有62種蛋白質被定量，且每一對之間差異表達的蛋白質組顯示重疊(圖2)，如25個蛋白質在160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃之間重疊[12]。以160 ℃與140 ℃的倍數變化閾值分別為>1.20或<0.83，其中8個蛋白質被指定為顯著上調[13]，而33個蛋白質在160 ℃后顯著下調。同樣的標準(折疊變化閾值>1.20或<0.83)用于選擇180 ℃與140 ℃組顯著變化(P<0.05)的差異蛋白質[14]，有18個差異蛋白被認為顯著上調，而28個差異蛋白在180 ℃后顯著下調。

2.3 差異表達蛋白質聚類分析

通過對140，160，180 ℃組的62個差異蛋白進行層次聚類分析，以揭示蛋白質變化的模式[15]，結果如圖3所示。由圖3可知，3組差異蛋白共得到10個對應于不同蛋白質變化模式的簇[16]。簇B、E和簇H由干燥溫度140～180 ℃前后差異顯著的蛋白質組成。具體來說，180 ℃ 干燥后，簇B、E顯示出10種蛋白質的表達量明顯下降，而簇H顯示出13種蛋白質在增加。簇F和簇G、C中，與140 ℃組相比，簇F共有5種蛋白質在160 ℃組中的表達量過高，但當干燥溫度上升至180 ℃時，這些蛋白質表達量顯著降低，與140 ℃組的相當，表明這些蛋白的高豐度可被視為低干燥出粉率的信號[17]。簇G、C共有9個與簇F相反的蛋白質組成，預測這些蛋白質在蛋清干燥過程中具有積極作用[18]。簇I和簇A、D在140 ℃組和180 ℃組之間表現出較大差異，但干燥溫度在160 ℃組和180 ℃組之間的蛋白質豐度差異不大。蛋白的差異模式有助于篩選與干燥和胚胎發(fā)育相關聯的蛋白[19]。

表1 差異蛋白質分析結果統(tǒng)計

圖2 160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃蛋清蛋白粉韋恩圖Figure 2 Venn diagrams of egg white protein powder at 160 ℃ vs 140 ℃ and 180 ℃ vs 140 ℃

圖3 差異表達蛋白質聚類分析Figure 3 Results of cluster analysis of differentially expressed proteins

2.4 差異表達蛋清蛋白粉的GO功能注釋分析

綜上可知，160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃兩組蛋清蛋白共鑒定62個差異蛋白，采用生物信息學軟件對已鑒定到的62個差異表達蛋清蛋白進行分析[20]。使用PANTHER分析在蛋清中檢測到蛋白質進行分類，并確定樣本中存在過多的蛋白質類別[21]。在20個生物過程和2個分子功能(圖4和表2)中發(fā)現顯著的過表達，且大部分的差異豐富的蛋白質與生物過程有關，例如細胞過程的GO-term反應(GO:0009987)、生物調節(jié)的GO-term反應(GO:0065007)和結合作用的GO-term反應(GO:0005488)等的富集度最高，表明參與細胞調節(jié)和免疫及催化反應調節(jié)的蛋白質數較多[22]。大多數差異豐度蛋白與親本GO-terms對細胞外區(qū)(GO:0005576)、細胞部分(GO:0044464)和細胞(GO:0005623)等有關，其參與的蛋白質數較多顯著過度表達，說明了蛋清對細胞的保護作用[23]。此外，在160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃兩組對比中，180 ℃ vs 140 ℃組中的蛋清差異蛋白數較多，可能是因為溫度差異越大，對蛋白質組的差異影響越大。查閱相關文獻[24]可知，其差異表達蛋白的某些注釋功能與蛋清液是相似的。

A. 細胞過程 B. 生物調節(jié) C. 單體過程 D. 生物過程調控 E. 應激反應 F. 代謝過程 G. 多細胞有機體過程 H. 發(fā)展過程 I. 生物過程負調節(jié) J. 細胞成分組織或生物發(fā)生 K. 胞外區(qū) L. 細胞 M. 細胞器 N. 細胞部分 O. 細胞外區(qū) P. 膜 Q. 薄膜部分 R. 細胞器部分 S. 結合 T. 分子功能調節(jié)

表2 差異蛋白的GO術語和途徑

2.5 差異表達蛋清蛋白粉的KEGG代謝通路分析

由圖5可知，140 ℃ vs 160 ℃后差異蛋白顯著變化與嘌呤代謝(gga00230)、剪接體(gga03040)和mRNA監(jiān)測途徑(gga03015)3條KEGG途徑有關[25]。140 ℃ vs 180 ℃后差異蛋白顯著變化與mRNA監(jiān)測途徑(gga03015)、煙酸和煙酰胺代謝(gga00760)和脂肪細胞因子信號途徑(gga04920)3條KEGG途徑有關。6個顯著變化的蛋白被歸類為代謝途徑，而顯著變化的差異蛋白則在溶酶體途徑(gga04142)中富集。大部分差別豐富的蛋白質與KEGG途徑(gga04080和gga04142)等有關[26]，其參與的蛋白質間接表達了參與途徑，為進一步分析蛋清粉品質提供了較好的支撐[27]。

圖5 160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃蛋清粉的差異蛋白的KEGG通路圖

2.6 蛋白質相互作用網絡分析(PPI)

篩選標準為蛋白質互作得分>0.9，共有18種差異表達蛋白(表3)的68種相互作用(圖6)。大部分蛋白質被消除，因為相互之間沒有任何聯系[28]，其中NP_989936.1、NP_001161204.1、NP_001026172.1、NP_990483.1、XP_025006934.1、NP_001077389.1和XP_015148067.1的連接度較高，具有7～11個互作蛋白，主要連接的通路有GO:0009987、GO:0065007、GO:0005488、GO:0005576、GO:0044464、GO:0005623、gga04080、gga03040、gga03015等[29]。

2.7 指示蛋白的篩選

查閱相關文獻[30]，再結合分析代謝通路比較組160 ℃ vs 140 ℃、180 ℃ vs 140 ℃兩組間共有的62個差異表達蛋白，從差異蛋白篩選出與蛋清蛋白密切相關的指示蛋白。由圖7可知，有4種蛋白質在噴霧干燥過程中豐度變化顯著，分別是卵白蛋白相關蛋白Y、卵白蛋白前體、卵類黏蛋白亞型X2及卵類黏蛋白亞型1前體。豐度變化顯著的原因可能是入口干燥溫度或樣品處理時發(fā)生的物理變化造成的。陳珂等[31]研究表明，噴霧干燥工藝會對雞蛋清蛋白的結構和功能特性造成一定的影響。

表3 網絡互作顯著變化的蛋白質

圖6 蛋白互作網絡圖Figure 6 Protein interaction network

2.7.1 卵白蛋白相關蛋白-Y和卵白蛋白前體 卵白蛋白相關蛋白-Y和卵白蛋白前體均屬于卵白蛋白中的一種，其各自的蛋白氨基酸序列高度同源且同屬于一個家族，但其發(fā)揮的作用各不相同；而這些不同與各自特殊的生理生化功能有關[32]。雞蛋清噴霧干燥過程中，卵白蛋白相關蛋白-Y和蛋白前體的豐度發(fā)生顯著變化，很可能是隨著干燥溫度的升高，蛋清卵白蛋白發(fā)生加速降解或卵白蛋白和堿性蛋白在干燥過程中發(fā)生結合造成的，其具體原因有待驗證。

2.7.2 卵類黏蛋白亞型X2和卵類黏蛋白亞型1前體

卵類黏蛋白亞型X2和卵類黏蛋白亞型1前體均屬于卵類黏蛋白中的一種。卵類黏蛋白是雞蛋清中的主要抗原蛋白之一，同時也是一種蛋白酶抑制劑和多功能的糖蛋白，其占蛋清蛋白的10%左右，并且有著高度同源的氨基酸序列[33]，等電點為4.0～4.6，蛋白分子量約為(28.0±1.5) kD。利用iTRAQ技術對蛋清蛋白進行鑒定，在雞蛋清蛋白中并沒有鑒定出卵類黏蛋白，但鑒定出卵類黏蛋白亞型X2和卵類黏蛋白亞型1前體，可能是干燥過程中，卵類黏蛋白受溫度的影響導致變性或者降解使這兩種蛋白質形成了結合物或者發(fā)生其他變化，但仍需進一步驗證。

3 結論

基于非標記定量(iTRAQ)技術和液相色譜—串聯質譜(LC-MS/MS)技術，分析蛋清蛋白在不同噴霧干燥入口溫度的差異表達蛋白質，并對其進行生物信息學分析。結果表明，160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃兩組中共有62種差異蛋白質，其中共同擁有的差異蛋白25個。蛋白質層次聚類分析熱圖表明，得到的差異蛋白質信息合理。將上述差異蛋白進行生物信息學分析得出其主要涉及發(fā)育過程、結合、刺激反應、催化、生物調節(jié)等生物學過程和分子功能。由蛋白質相互作用網絡分析可以得到全面系統(tǒng)的分子層面的細胞活動模型，以便于對分子機制的深入研究。

圖7 二級質譜圖Figure 7 Secondary mass spectrum

在不同入口干燥溫度蛋清蛋白差異蛋白質組中發(fā)現有4個蛋白質變化較為明顯，分別為卵白蛋白相關蛋白-Y、卵白蛋白前體、卵類黏蛋白亞型X2和卵類黏蛋白亞型1前體，在功能注釋、信號通路和蛋白質互作中變化顯著。因此，這4個差異蛋白質均有望作為蛋清蛋白干燥過程中的指示蛋白。