β1?AA下調(diào)脂聯(lián)素水平誘發(fā)糖尿病的機(jī)制研究

何立娟 張鳳麗 李躍 袁慧

1清華大學(xué)醫(yī)院（北京100084）；2北京安貞醫(yī)院（北京100029）

糖尿病是一種以慢性血糖水平增高為特征的代謝紊亂性疾病，是心腦血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，已成為嚴(yán)重危害公眾健康的重要因素之一［1］。2013年研究報(bào)道我國(guó)成年人糖尿病的患病率高達(dá)11.6%，臨床前期糖尿病的患病率為50%左右［2］，已成為威脅人類健康的主要問題。已知糖尿病的發(fā)生機(jī)制有胰島素抵抗及胰島細(xì)胞分泌缺陷［3］，雖然臨床上針對(duì)這些機(jī)制的治療可以控制糖尿病患者的血糖水平，但仍無法徹底治愈糖尿病，這無疑與其他未知因素有關(guān)。

β1腎上腺素受體自身抗體（autoantibodies against the second extracellular loop of the β1?adrenoceptor，β1?AA）是一種針對(duì)β1腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)產(chǎn)生的自身抗體。大量研究［4-6］表明，β1?AA 參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，前期研究［7］證實(shí)，β1?AA 可通過調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞導(dǎo)致血糖升高，這提示β1?AA可能在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制尚未明確。因此，進(jìn)一步探究β1?AA 在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用對(duì)糖尿病的臨床治療有重要的意義。

脂聯(lián)素（adiponectin，APN）是一種由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子，主要的作用包括胰島素增敏、抗炎及抗血管損傷［8］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可以通過抑制肝糖異生，促進(jìn)脂肪酸氧化、胰島素分泌及骨骼肌中糖攝取發(fā)揮降血糖作用［9］。研究顯示，脂聯(lián)素水平與肥胖指標(biāo)及胰島素抵抗指標(biāo)成負(fù)相關(guān)［10］，脂聯(lián)素水平的降低在肥胖相關(guān)疾病（包括胰島素抵抗、2 型糖尿病和心血管疾病）中起著重要作用［11］，提示脂聯(lián)素的降低可能參與糖尿病的發(fā)生。

因此，本研究的目的：（1）明確β1?AA 是否誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生；（2）檢測(cè)β1?AA 誘導(dǎo)糖尿病過程中脂聯(lián)素水平的改變，明確脂聯(lián)素水平的改變與β1?AA 誘導(dǎo)糖尿病之間是否存在因果關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本選取2016年6月至2017年6月于北京市安貞醫(yī)院和清華大學(xué)醫(yī)院住院的糖尿病患者45 例作為實(shí)驗(yàn)組，其中男27 例，女18 例，平均年齡（57.94±9.25）歲。糖尿病患者的入選標(biāo)準(zhǔn)是臨床確診為2 型糖尿病：（1）空腹8 h 以上，血糖>7.0 mmol/L；（2）餐后2 h 測(cè)血糖>11.1%；（3）糖化血紅蛋白> 6.5%；（4）有糖尿病的相關(guān)癥狀，如口干、多飲等典型癥狀。同時(shí)入選45 例本院健康體檢者作為對(duì)照組，其中女20 例，男25 例，平均年齡（56.76±9.42）歲。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往無血糖升高史；（2）非妊娠期婦女；（3）沒有胰島功能障礙者。全部病例排除伴全身疾病（感染、腫瘤等）、自身免疫性疾病、有認(rèn)知問題及精神障礙。本研究所有研究對(duì)象均需簽訂書面知情同意書且本研究已通過道德倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，病例樣本的一般資料見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康C57 小鼠（雄性，8 周齡，體質(zhì)量18～22 g）由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于無病原體的室溫環(huán)境中，并且每天以12∶12 h 明暗的時(shí)間暴露于暗光條件下。在整個(gè)研究期間，動(dòng)物隨意采食。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理機(jī)構(gòu)委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)均按照中華人民共和國(guó)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。

表1 糖尿病患者和健康體檢者臨床資料Tab.1 Clinical data of diabetic patients and healthy subjects ±s

表1 糖尿病患者和健康體檢者臨床資料Tab.1 Clinical data of diabetic patients and healthy subjects ±s

注：LDH，乳酸脫氫酶；LDL?C，低密度脂蛋白膽固醇；HDL?C，高密度脂蛋白膽固醇；CK，肌酸激酶；MMB，CKMB 同工酶；BNP，腦鈉肽；AST，谷草轉(zhuǎn)氨酶

項(xiàng)目性別（男/女）年齡（歲）血糖（mmol/L）糖化血紅蛋白（%）糖化血清白蛋白（%）餐后2 h 血糖（mmol/L）空腹胰島素（μU/mL）甘油三酯（mmol/L）總膽固醇（mmol/L）C 反應(yīng)蛋白（mg/L）LDH（U/L）LDL?C（mmol/L）HDL?C（mmol/L）CK（U/L）MMB（ng/mL）BNP（μg/L）AST（U/L）健康對(duì)照組（n=45）25/20 56.76±9.42 5.20±0.66 5.51±0.36 13.16±4.02/8.12±3.54 1.34±0.75 4.83±1.01 1.94±2.34 1.38±0.49 2.87±0.87 1.40±0.50 93.25±16.84 0.95±0.28 21.07±7.66 21.06±7.65糖尿病組（n=45）28/17 57.94±9.25 8.37±2.42 8.30±2.37 20.86±6.58 15.08±6.23 19.86±33.39 1.95±2.54 4.61±1.15 1.96±3.53 188.75±72.2 2.61±0.78 1.21±0.56 100.8±54.74 1.73±1.90/23.59±16.66

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肽段的合成及主動(dòng)免疫抗原肽段的合成：首先根據(jù)人β1?腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)（β1?AR?ECII）的氨基酸序列（197aa?223aa，人鼠同源性100%），委托上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成長(zhǎng)肽和短肽各一條，采用高壓液相色譜儀分析合成肽段的純度在98%以上，肽段的氨基酸序列分別為：H?W?W?R?A?E?S?D?E?A?R?R?C?Y?N?D?P?K?C?C?D?F?V?T?N?R?C 和C?H?W?W?R?A?E?S?D?E?A?R?R。

主動(dòng)免疫：將β1?AA 陰性的8 周齡健康C57 小鼠隨機(jī)分為兩組。對(duì)照組（n=15）的小鼠用生理鹽水和免疫佐劑的混合物免疫，而β1?AA 組（n=15）的小鼠用人工合成的β1?AR?ECII 和免疫佐劑的混合物免疫。將β1?AR?ECII 溶于Na2CO3溶液（pH 11.0）中，與相同體積的完全弗氏佐劑（Sigma?Aldrich，St.Louis，MO，USA）混合，然后以濃度為0.4 μg/g 皮下注射（初次免疫）。在初次免疫后1周，向一個(gè)后部位點(diǎn)加強(qiáng)皮下注射。然后每2 周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。在每次加強(qiáng)注射前1 d 收集血樣。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）血清中β1?AA的水平采用改良的ELISA 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)［12］。具體步驟如下：合成的人β1?AR?ECII抗原肽用碳酸鹽緩沖液（pH 11.0）溶解后，以1 μg/mL 的劑量包被至96 孔板中，4 ℃過夜。加入0.1%的PMT 溶液［0.1%（w/v）牛白蛋白0.1%（v/v），加入吐溫20 的磷酸鹽緩沖液，pH 7.4、37 ℃封閉1 h，PBS?T 清洗3 次，每次5 min。之后將50 μL 待測(cè)血清樣品用PMT 溶液按1∶10（v/v）稀釋后加至微孔板中，37 ℃孵育1 h，PBS?T 清洗5 min×3 次。再將生物素化山羊抗人IgG（PMT 稀釋的1∶4 500，Sigma）加入反應(yīng)板中，37 ℃孵育1 h。3 次清洗后，加入親和素化過氧化物酶（PMT 稀釋1∶2 000，Sigma），相同條件孵育清洗。最后，2，2?azino?di（3?ethylbenzothiazoline）sul?phonic acid（ABTS）?H2O2（Roche，Basel，Switzerland）底物溶液加入微孔板中，37 ℃避光孵育30 min。酶標(biāo)儀（Spectra Max Plus，Molecular Devices Corp，CA，USA）在405 nm 波長(zhǎng)處讀取OD值，檢測(cè)樣本OD值與陰性對(duì)照OD值之比>2.1 即判斷檢驗(yàn)樣品為陽性，若其比值<1.5 則為陰性。

1.3.3 β1?AA 純化IgGs 的提純及鑒定從β1?AA陽性糖尿病患者分離血清，利用IgGs 親和純化試劑盒（MabTrap Kit）提純血清中IgGs。3 mL 結(jié)合緩沖液平衡親和柱（流速0.5 mL/min）；0.5 mL 血清與等體積結(jié)合緩沖液稀釋后加入柱體中；用7 mL 結(jié)合緩沖液沖洗親和柱；5 mL 洗脫緩沖液洗出柱內(nèi)IgGs，收集到預(yù)先裝有中和緩沖液（保持蛋白活性）的離心管中，隨后將提純的IgGs 進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)［BCA（bicinchoninic acid）試劑盒（Pierce，美國(guó)）］，用SDS?PAGE 凝膠電泳法檢測(cè)其純度。

1.3.4 乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率的檢測(cè)提取的心肌細(xì)胞接種于96 孔板，培養(yǎng)2～3 d，實(shí)驗(yàn)分組為陰性IgG 組、β1?AA 組（10-7mol/L）、β1?AA（10-7mol/L）+β1?AR 阻斷劑metoprolol 組（3×10-7mol/L）和單獨(dú)的metoprolol 組（3×10-7mol/L）；加入阻斷劑1 h后再加入β1?AA 作用48 h，顯微鏡下每組觀察7～8 個(gè)培養(yǎng)孔，每個(gè)培養(yǎng)孔隨機(jī)計(jì)數(shù)6～8 個(gè)視野，每個(gè)視野每次計(jì)數(shù)30 s，最后計(jì)數(shù)分離的單個(gè)細(xì)胞1 min 內(nèi)同步收縮的次數(shù)，驗(yàn)證β1?AA 的生物活性。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分化3T3?L1細(xì)胞在含10%FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，以0.25%的胰蛋白酶消化，傳代至6 孔板。待細(xì)胞融合2 d 后，先加0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L 地塞米松、10 mg/L 胰島素，培養(yǎng)48 h，然后換含10% FBS 和10 mg/L 胰島素的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，然后換成僅含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4～6 d。誘導(dǎo)分化8～12 d 的3T3?L1 細(xì)胞90%以上呈脂肪細(xì)胞表型，分別用10-6、10-7、10-8mol/L 濃度的β1?AA 給予刺激24 h。

1.3.6 血清中脂聯(lián)素的檢測(cè)脂聯(lián)素主要由脂肪細(xì)胞分泌［13］，為了探究脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的分泌是否受β1?AA 影響，首先將3T3?L1 前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞，然后用不同濃度的β1?AA 刺激脂肪細(xì)胞24 h，患者血清中脂聯(lián)素水平應(yīng)用人脂聯(lián)素ELISA試劑盒（國(guó)產(chǎn)）進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟詳見說明書。

1.3.7 Western blot脂肪組織及心肌組織蛋白濃度用BCA 方法檢測(cè)。蛋白上樣量為每孔20 μg，分離膠濃度為10%，恒壓80 V，電泳1 h，400 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1 h，按照0.1 mL/cm2加入5%脫脂奶粉封閉液，盡可能排除里面的氣泡，室溫孵育1 h。加入稀釋于2.5 %脫脂奶粉的一抗（一抗稀釋度為1∶1 000）4 ℃孵育過夜后棄去一抗，用TBST 洗3 次，每次5 min。棄去一抗加入1∶5 000稀釋的相應(yīng)二抗，室溫?fù)u動(dòng)1 h，棄去二抗，用TBST 洗膜3 次，每次5 min。采用化學(xué)發(fā)光試劑（PIERCE公司）檢測(cè)蛋白。

1.3.8 實(shí)時(shí)定量PCR引物由生工生物工程（北京）合成（表2），使用Trizol 試劑（Invitrogen，US）從冷凍脂肪組織中提取總RNA。紫外吸收測(cè)定法測(cè)定RNA 在分光光度計(jì)260 nm 和280 nm 處的吸收值，計(jì)算其濃度并評(píng)估RNA 純度，使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)說明書由SYBR?Premix Ex（Life Technologies，USA）定量。使用2-ΔΔCt方法，計(jì)算結(jié)果。

1.3.9 標(biāo)記法芯片技術(shù)收集主動(dòng)免疫小鼠外周血清，利用AAM?BLG?1 試劑盒（RayBiotech，Inc.Guangzhou）檢測(cè)外周血清中發(fā)生改變的細(xì)胞因子，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行操作。采用數(shù)據(jù)分析軟件—AAM?BLG?1 來進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)分析。

表2 RT?qPCR 引物Tab.2 Primers of RT?qPCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以M（P25，P75）表示，比較用Mann?WhitneyU檢驗(yàn)或者Kruskal?WallisH檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β1?AA IgGs 增加乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率從β1?AA 陽性糖尿病患者血清中分離的β1?AA IgGs（25 μg/mL）可增加乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率（圖1），其作用類似于β1?腎上腺素能受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素（ISO），而β1?腎上腺素能受體拮抗劑美托洛爾（1 μmol/L）可以消除β1?AA IgGs 的這種作用。

2.2 β1?AA 及脂聯(lián)素在糖尿病患者血清中的分布與正常體檢組相比，糖尿病患者血清中β1?AA水平顯著增高［（0.82±0.31）vs.（0.12±0.10），P<0.001，圖2A］。且在45 例糖尿病患者中有26 例呈β1?AA 陽性，其陽性率顯著高于對(duì)照組（57.7%vs.1.1%，圖2B）；而脂聯(lián)素濃度明顯低于對(duì)照組［（14.52±3.76）ng/mLvs.（25.87±8.93）ng/mL，P<0.001，圖2C］；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，β1?AA 水平與脂聯(lián)素水平呈負(fù)相關(guān)（圖2D）。

圖1 糖尿病患者血清中β1?AA 增加乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率Fig.1 β1?AA in serum of diabetic patients increases beating frequency of neonatal rat cardiomyocytes

圖2 糖尿病患者中β1?AA 水平和脂聯(lián)素濃度Fig.2 Levels of β1?AA and adiponectin in diabetic patients

2.3 β1?AA長(zhǎng)期存在可誘導(dǎo)C57小鼠血糖升高結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，主動(dòng)免疫8 周時(shí)，免疫組小鼠空腹血糖明顯較高［（14.0±0.81）mmol/Lvs.（5.03±0.21）mmol/L，P<0.001］，見圖3A；同時(shí)，腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)免疫8 周，小鼠在糖負(fù)荷后30 min 和60 min 時(shí)，血糖也明顯高于對(duì)照組［（13.0±1.5）mmol/Lvs.（7.70±1.21）mmol/L，P<0.01］，見圖3。以上結(jié)果初步提示，β1?AA 長(zhǎng)期存在可能誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生。利用蛋白芯片技術(shù)篩選主動(dòng)免疫小鼠外周血清中發(fā)生改變的細(xì)胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素水平在主動(dòng)免疫8 周時(shí)明顯低于對(duì)照組（表3），提示β1?AA 通過下調(diào)脂聯(lián)素的水平誘導(dǎo)小鼠血糖升高。

表3 蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)主動(dòng)免疫小鼠外周血清細(xì)胞因子的水平Tab.3 The level of serum cytokines in active immunized mice

2.4 β1?AA 可下調(diào)脂肪組織中脂聯(lián)素水平結(jié)果顯示，脂肪組織中脂聯(lián)素蛋白水平及mRNA 水平顯著低于對(duì)照組（圖4），進(jìn)一步提示脂聯(lián)素水平的減少參與糖尿病的發(fā)生。

圖3 β1?AA 誘導(dǎo)C57 小鼠血糖升高Fig.3 β1?AA induces hyperglycemia in C57 mice

圖4 β1?AA 誘導(dǎo)脂肪組織中脂聯(lián)素水平降低Fig.4 Decrease of adiponectin level in adipose tissue induced by β1?AA

圖5 β1?AA 減少3T3?L1 細(xì)胞中脂聯(lián)素分泌Fig.5 β1?AA reduces adiponectin secretion in 3T3?L1 cells

2.5 β1?AA 減少脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素分泌結(jié)果顯示，脂聯(lián)素蛋白表達(dá)和mRNA 水平隨著β1?AA 濃度的增高均逐漸下降（圖5）。

3 討論

糖尿病是一種慢性復(fù)雜的內(nèi)分泌代謝紊亂，也是導(dǎo)致全球人群死亡的重要因素之一，嚴(yán)重威脅社會(huì)公眾健康［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血清中β1?AA 滴度及陽性率均顯著高于健康對(duì)照組人群，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)β1?AA 長(zhǎng)期存在可導(dǎo)致小鼠血糖升高；主動(dòng)免疫8 周時(shí)小鼠外周血清中脂聯(lián)素水平顯著降低，同時(shí)，從臨床水平證實(shí)糖尿病患者血清中脂聯(lián)素水平低于健康對(duì)照組；進(jìn)一步從細(xì)胞水平驗(yàn)證β1?AA 長(zhǎng)期存在可下調(diào)脂聯(lián)素水平。以上結(jié)果初步提示，β1?AA 可通過下調(diào)脂聯(lián)素水平而誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生。

以往研究表明，β1?AA 被動(dòng)免疫可增加大鼠和小鼠的血糖水平，在被動(dòng)免疫大鼠模型中，免疫期間觀察到血糖水平隨時(shí)間增加，并在第24 周達(dá)到峰值［7］。本研究從β1?AA 陽性的糖尿病患者提取出的總IgG 主動(dòng)免疫小鼠8 周時(shí)，可以引起空腹血糖升高及腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)陽性，與以往的報(bào)道一致。

研究顯示脂聯(lián)素在胰島素增敏（胰島素代謝調(diào)節(jié)）、抗炎及抗缺血損傷及癌癥的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［15-16］。研究［17］發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可以促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞脂肪酸的氧化和糖吸收，抑制肝臟的糖生成，是機(jī)體的血糖調(diào)節(jié)和脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子。研究［18］顯示2 型糖尿病和有心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的肥胖患者脂聯(lián)素水平低，而脂聯(lián)素基因療法可以減輕炎癥反應(yīng)，提高胰島素的敏感性。本研究結(jié)果初步提示脂聯(lián)素水平的降低在β1?AA 誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生中具有重要作用。但是β1?AA 是通過怎樣的信號(hào)通路誘導(dǎo)脂聯(lián)素降低進(jìn)而導(dǎo)致血糖升高尚不清楚。

由于本研究在主動(dòng)免疫8 周時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠血糖升高，不能確定8 周是否是血糖升高的峰值時(shí)間，因此下一步計(jì)劃延長(zhǎng)主動(dòng)免疫的時(shí)間，尋找血糖升高的峰值時(shí)間，并探究β1?AA 誘導(dǎo)脂聯(lián)素下降的機(jī)制。