氟中毒通過引起p16功能障礙抑制成骨細(xì)胞功能的機(jī)制

范淑玲 宋小東 趙玉芳

江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖與組胚教研室（江西上饒334000）

過度消耗氟化物會(huì)損害多個(gè)器官和系統(tǒng)，尤其是骨骼和牙齒，可分別導(dǎo)致氟骨癥和牙質(zhì)氟骨癥［1］。氟骨癥的特征是骨質(zhì)改變，包括骨硬化、骨軟化或骨質(zhì)疏松［2］。氟骨癥病變的發(fā)生和發(fā)展與成骨細(xì)胞的異常增殖和活化有關(guān)［3］。NaF已被證明可通過改變細(xì)胞周期進(jìn)程誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡［4］。p16 蛋白作為負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Rb）的磷酸化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族成員的CDK4/6，故p16 基因功能的喪失阻止細(xì)胞周期抑制。組蛋白乙酰化與基因激活相關(guān)，去乙酰化與基因抑制相關(guān)［6］。蛋白尾巴的乙酰化發(fā)生在特定的位點(diǎn)和殘基上，通過調(diào)控RNA 聚合酶Ⅱ和轉(zhuǎn)錄因子的DNA 可達(dá)性來控制基因表達(dá)。特異性蛋白1（Sp1）是轉(zhuǎn)錄因子，激活的Sp1蛋白識(shí)別p16 啟動(dòng)子中保守的Sp1?response 元件并進(jìn)行調(diào)控其誘導(dǎo)［7-8］。組蛋白去乙酰化直接影響轉(zhuǎn)錄因子Sp1 的結(jié)合效率。本研究探究氟中毒通過引起p16 功能障礙抑制成骨細(xì)胞功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24 周齡體質(zhì)量200 g 的雄性SPF級(jí)SD 大鼠48 只購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)室合格證號(hào)為SCXK?（軍）2017?0004；飼養(yǎng)條件資質(zhì)號(hào)碼：SYXK?（軍）2017?0004；動(dòng)物使用的倫理審批號(hào)IACUC：2018?650?7001）。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（n=12），自來水（氟離子濃度< 0.5 mg/L）；高氟組（n=12），氟化鈉（氟離子濃度33.00 mg/L）；中氟組（n=12），氟化鈉（氟離子濃度16.50 mg/L）；低氟組（n=12），氟化鈉（氟離子濃度8.25 mg/L）。實(shí)驗(yàn)遵循3R 原則。氟化鈉的喂養(yǎng)方式為氟化鈉溶液灌胃，喂養(yǎng)頻率為每天1次，攝入量為5 mL/次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 突觸體鈣離子濃度的測(cè)量18 個(gè)月后，當(dāng)氟暴露完成后，實(shí)驗(yàn)鼠頸椎脫臼處死，突觸體被分離。對(duì)突觸體鈣離子濃度進(jìn)行測(cè)量測(cè)量。

1.2.2 成骨細(xì)胞活力分析采用3?（4，5?二甲基噻唑?2?yl）?2，4?二苯基四唑溴化銨（MTT）法（試劑購(gòu)自上海碧云天公司）檢測(cè)NaF 對(duì)細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞平鋪在96 孔板中，細(xì)胞密度1×104，細(xì)胞粘附后孵育24 h。之后每孔加入20 μmol/L TT溶液（最終濃度為0.5 mg/mL），37 ℃孵育4 h；之后，棄去上清，每孔加入150 μL 二甲亞砜（DMSO）（試劑購(gòu)自上海碧云天公司），充分震蕩10 min，用微平板閱讀器（試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Electron 公司）在490 nm 處定量測(cè)定吸光度。

1.2.3 細(xì)胞周期分析流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期內(nèi)細(xì)胞的分布。用碘化丙啶染色DNA 測(cè)定細(xì)胞周期分布。每組取約1.0×106個(gè)細(xì)胞，用2.5 mg/mL胰蛋白酶分離，用PBS 洗滌2 次，然后用70%冷乙醇在4 ℃固定4 h。然后將細(xì)胞洗兩次PBS。加入50 μg/mL 含核糖核酸酶A（50 μg/mL）的碘化丙啶溶液（試劑購(gòu)自上海碧云天公司），37 ℃黑暗中孵化為30 min。使用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞周期各階段的細(xì)胞百分率，然后使用ModFit 軟件進(jìn)行分析。增殖指數(shù)（PI）計(jì)算公式為：PI=（S + G2/M）/（S+G2/M+G0/G1）。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用TRIzol 按標(biāo)準(zhǔn)程序提取細(xì)胞中總RNA（試劑購(gòu)自上海碧云天公司）。用納米Drop2000C 測(cè)定RNA 濃度和純度后，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄總RNA（1 μg），按照制造商協(xié)議進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在ABI PRISM 7500 序列檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用25 ng的cDNA，定量SYBR green master mix 檢測(cè)單個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平。RT 反應(yīng)體系（20 μL）見表1，反應(yīng)條件見表2，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，使用北京全式金生物技術(shù)公司合成下列相關(guān)引物，模板為cDNA，內(nèi)參為GAPDH。對(duì)應(yīng)基因引物序列見表3。

表1 cDNA 反轉(zhuǎn)錄體系Tab.1 cDNA reverse transcription system

表2 qPCR 反應(yīng)條件Tab.2 qPCR reaction conditions

表3 引物的核苷酸序列Tab.3 Nucleotide sequence of primers

1.2.5 Western blot提取總蛋白，測(cè)蛋白濃度。取20 μg蛋白質(zhì)電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，在4 ℃孵育過夜，把膜膜放入平皿中，向容器中加入5%脫脂奶粉至完全將膜覆蓋，搖床中封閉2 h；棄去脫脂奶粉溶液，取出膜置于TBST 中洗滌3次，每次5 min；加一抗（抗體anti?p16（1∶3 000）和β?actin（1∶3 000），4 ℃孵育過液，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗（稀釋1∶500，試劑購(gòu)自美國(guó)protein intech 公司）孵育2 h 后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司）檢測(cè)。用Quantity One軟件進(jìn)行密度分析條帶相對(duì)密度。

1.2.6 染色質(zhì)免疫沉淀分析EZ?Magna ChIP TM A/G 抗乙酰組蛋白h3（lys9）、抗乙酰組蛋白h3（lys14）、抗乙酰組蛋白h4（lys12）、抗乙酰組蛋白h4（lys16）和抗sp1 抗體試劑盒進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（芯片）檢測(cè)。簡(jiǎn)單地說，用1% 甲醛處理細(xì)胞10 min，使組蛋白與DNA交聯(lián)。洗滌后的細(xì)胞顆粒懸浮在5 μL 溶解液中，在 超聲儀中進(jìn)行18 次超聲處理每次9.9 s。以5 μL的上清液為輸入，在剩余的上清液中加入5 μL 的免疫沉淀抗體和20 μL 的懸浮蛋白A/G磁珠。以抗RNA聚合酶為陽(yáng)性對(duì)照，以正常小鼠IgG 為陰性對(duì)照。將ChIP 反應(yīng)混合物與抗體在4 ℃孵育過夜。收集蛋白A/G串珠抗體/染色質(zhì)復(fù)合物，在冷緩沖液中洗滌，洗脫，然后反向交聯(lián)，用蛋白酶K 在62 ℃下消化2 h。用旋轉(zhuǎn)柱從上清液中提取純化了DNA，利用免疫沉淀法擴(kuò)增p16基因的3個(gè)片段，分別由ChIP 1、ChIP 2和ChIP 3引物對(duì)輸入DNA。引物設(shè)計(jì)見表4。利用cfx96TM 實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)SYBR 混合預(yù)混劑extaqtm ii1 擴(kuò)增免疫沉淀促進(jìn)基因組DNA 的差異。

表4 ChIP 1、ChIP 2、ChIP3 引物設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.4 Primer design results of ChIP 1，ChIP 2 and ChIP 3

1.3 動(dòng)物質(zhì)量測(cè)量干預(yù)18個(gè)月后測(cè)量大鼠的質(zhì)量，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析排除因營(yíng)養(yǎng)不良等因素造成的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件（美國(guó)IBM 公司）；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測(cè)量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2分析；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氟對(duì)海馬［Ca2+］的影響所有氟處理組［Ca2+］均升高，中?氟組和高?氟組升高（P<0.05），與高?氟組于中?氟組相比出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，見表5。

表5 氟對(duì)海馬［Ca2+］的影響Tab.5 Effect of fluoride on［Ca2 +］in hippocampus ±s

表5 氟對(duì)海馬［Ca2+］的影響Tab.5 Effect of fluoride on［Ca2 +］in hippocampus ±s

組別對(duì)照組低-氟組中-氟組高-氟組F 值P 值例數(shù)12 12 12 12［Ca2+］（nmol/L）315.45±6.03 331.31±7.01 378.04±9.03 359.03±7.02 103.922<0.001

2.2 氟化物增加細(xì)胞活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖隨著NaF 劑量的增加，細(xì)胞生存能力與其濃度呈依賴關(guān)系。與正常組相比，中?氟組細(xì)胞增殖能力增加（P<0.05）。隨著氟濃度的逐漸增加，高?氟組細(xì)胞增殖能力下降。見表6。

表6 骨細(xì)胞增殖能力測(cè)定結(jié)果Tab.6 Measurement results of osteocyte proliferation

2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定氟對(duì)成骨細(xì)胞的影響NaF可使S 期細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性增加（P< 0.05），隨著NaF 濃度的升高，S 期和G2/M 期細(xì)胞比例增加，而G0/G1 期細(xì)胞比例呈劑量依賴性下降。隨著NaF 濃度的增加，PI 呈劑量依賴性增加（P<0.05）。提示NaF 可影響細(xì)胞周期從G1 期向S 期的進(jìn)展，可能導(dǎo)致成骨細(xì)胞通過G1 期迅速進(jìn)入S 期，說明NaF 對(duì)成骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用，但NaF 濃度過高（高?氟組）的細(xì)胞增殖能力出現(xiàn)下降的趨勢(shì)（P<0.05）。見表7、圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期Fig.1 Cell cycle detected by flow cytometry

表7 G0/G1 期、S 期、G2/M 期細(xì)胞數(shù)量百分比Tab.7 Percentage of cells in G0/G1，s and G2/M stages ±s

表7 G0/G1 期、S 期、G2/M 期細(xì)胞數(shù)量百分比Tab.7 Percentage of cells in G0/G1，s and G2/M stages ±s

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2.4 氟化物降低了成骨細(xì)胞中p16 的mRNA 和蛋白水平p16 的mRNA 水平（P< 0.05）和蛋白水平（P<0.05）呈劑量依賴性下調(diào)。見表8、9，圖2。

表8 p16 mRNA 相對(duì)表達(dá)量Tab.8 Relative expression of p16 mRNA ±s

表8 p16 mRNA 相對(duì)表達(dá)量Tab.8 Relative expression of p16 mRNA ±s

組別對(duì)照組低-氟組中-氟組高-氟組F 值P 值例數(shù)12 12 12 12 p16 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（%）0.98±0.11 0.76±0.21 0.37±0.12 0.12±0.03 102.24<0.001

圖2 Western blot 測(cè)定p16 蛋白表達(dá)量Fig.2 Western blot determination of p16 protein expression

2.5 染色質(zhì)免疫沉淀分析結(jié)果與空白組相比，在高?氟化鈉治療組，H3ac、H4ac、H3K4、H4K20 的組蛋白脫乙酰作用更強(qiáng)（P<0.05）。見圖3。

表9 p16 蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.9 Relative expression of p16 protein ±s

表9 p16 蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.9 Relative expression of p16 protein ±s

組別對(duì)照組低-氟組中-氟組高-氟組F 值P 值例數(shù)12 12 12 12 p16 蛋白相對(duì)表達(dá)量（%）0.99±0.21 0.62±0.13 0.43±0.14 0.23±0.04 104.09<0.001

2.6 動(dòng)物質(zhì)量測(cè)量干預(yù)18個(gè)月后大鼠的質(zhì)量增加，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，可排除因營(yíng)養(yǎng)不良等因素造成的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表10。

3 討論

氟化物是一種有益的微量元素，能維持機(jī)體健康；然而，長(zhǎng)期過量攝入氟化物會(huì)導(dǎo)致慢性氟中毒。慢性氟中毒對(duì)機(jī)體的影響主要表現(xiàn)為骨骼和氟斑牙、血、肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)損害。神經(jīng)細(xì)胞鈣超載是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要機(jī)制之一，通過對(duì)腦缺血繼發(fā)性損傷過程的分析，得出了這一結(jié)論。鈣超載參與早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段更為重要。海馬是鈣超載引起神經(jīng)損傷的重要靶器官。在本研究中，氟暴露增加了海馬CA3 區(qū)［Ca2+］。提示在慢性氟中毒作用下，鈣內(nèi)流引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，且這種增加具有一定的規(guī)律性，與氟劑量的增加有關(guān)。LIU 等［9］發(fā)現(xiàn)七氟醚組大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)的calpain［Ca2+］和76/80 kDa 在麻醉后1 d 水平升高。

表10 動(dòng)物質(zhì)量測(cè)量Tab.10 Animal quality measurement ±s

表10 動(dòng)物質(zhì)量測(cè)量Tab.10 Animal quality measurement ±s

組別對(duì)照組低-氟組中-氟組高-氟組F 值P 值例數(shù)12 12 12 12動(dòng)物質(zhì)量（g）256.93±9.58 260.27±10.72 256.50±12.65 266.98±10.87 6.926 0.099

然而，目前對(duì)于骨架的最佳發(fā)育和生長(zhǎng)是否有必要還缺乏共識(shí)。氟中毒常見于發(fā)展中國(guó)家［10-11］。氟化物是一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖和破壞細(xì)胞周期進(jìn)程，導(dǎo)致氟骨癥的發(fā)生。本研究中，NaF 處理導(dǎo)致細(xì)胞活力增加，細(xì)胞周期S 期細(xì)胞積累，并以劑量依賴的方式促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。本研究的發(fā)現(xiàn)與之前的研究結(jié)果一致［12］，進(jìn)一步驗(yàn)證了NaF 破壞正常細(xì)胞周期模式并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞異常增殖和激活的假說。然而，細(xì)胞周期的進(jìn)展受到各種調(diào)節(jié)蛋白的控制：細(xì)胞周期蛋白及其輔因子、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）。

p16 蛋白通過抑制cyclin D/CDK4 和cyclin D/CDK6 復(fù)合物磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）來控制G1 期細(xì)胞周期增殖［8］。本研究觀察到在NaF 暴露的人類初級(jí)成骨細(xì)胞中，p16 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制被組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）TSA 逆轉(zhuǎn)，這意味著p16 的抑制是由于組蛋白乙酰化的異常調(diào)節(jié)。

以前的大多數(shù)研究都集中在接觸氟化物所引起的基因改變上［13-14］。本文研究各種表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，以闡明氟的生物毒性，包括非編碼RNA的表達(dá)和DNA 甲基化的改變［15-16］。同時(shí)，有假說認(rèn)為組蛋白乙酰化修飾參與了氟所致的骨科和非骨科損傷［17］。組蛋白乙酰化調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。乙酰基修飾的組蛋白使帶正電的賴氨酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，從而削弱組蛋白與帶負(fù)電的DNA 之間的靜電相互作用。相比之下，組蛋白去乙酰化酶可以去除乙酰基，使組蛋白與DNA 相互作用更緊密，抑制基因轉(zhuǎn)錄［18］。

去乙酰化改變了染色質(zhì)的緊密程度，壓縮了染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其不易被調(diào)節(jié)因子所調(diào)控［19］。許多轉(zhuǎn)錄因子通過分布在p16 啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)元件參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。許多轉(zhuǎn)錄因子通過分布在p16 啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)元件參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比，在高?氟化鈉治療組，H3ac、H4ac、H3K4、H4K20 的組蛋白脫乙酰作用更強(qiáng)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，暴露于不同濃度的氟后，S 期和G2/M 期的比例均上升，而TSA 可以逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)。提示DNA 損傷可能參與了氟中毒的進(jìn)展［20-22］。氟化鈉誘導(dǎo)p16 基因組蛋白脫乙酰作用，從而促進(jìn)骨細(xì)胞生存能力和促進(jìn)人類主要的成骨細(xì)胞增殖。綜上所述，氟中毒通過引起p16 基因乙酰化抑制成骨細(xì)胞的功能。