髓樣分化因子88對姜黃素誘導肝星狀細胞凋亡的影響分析

廣州市紅十字會醫院（510240）童巧勤

肝臟纖維化是肝臟自身對一系列慢性刺激作出的自我修復反應，目前已知肝臟纖維化的中心環節是肝星狀細胞的增殖與活化[1]。現有研究表明，姜黃素促進肝臟星狀細胞的凋亡從而起到抗肝纖維化的目的，其主要可能機制是姜黃素能夠抑制星狀細胞Ⅰ型膠原蛋白α1的表達以及其他一系列的信號通路的改變，其中較為重要的是髓樣分化因子88（MyD88）依賴性信號通路，而MyD88是該信號通路中的一項重要蛋白[2]。而MyD88是否在姜黃素抑制星狀細胞的凋亡過程中起到一定作用，目前尚未可知，本研究即探究MyD88對姜黃素抑制星狀細胞的凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 基本資料 本次研究所用到的主要試劑與材料有肝星狀細胞株HSC-T6、姜黃素、MyD88 siRNA、特級新生小牛血清、胰蛋白酶、MyD88抗體、一抗二抗剝脫液等。其來源統計如附表1。

1.2 方法 細胞培養：采用大鼠肝星狀細胞株HSC-T6，細胞株培養在含 100 U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養液中。細胞培養箱條件為37℃，含有5%CO2。以下所有實驗用細胞均取對數生長期細胞。

細胞傳代：待培養瓶中的細胞生長至約90%融合時，進行細胞傳代。從培養箱中取出培養瓶，倒掉培養液后，向瓶內加入1ml消化液（0.25%胰蛋白酶）輕輕搖動培養瓶，然后倒掉消化液，再加入1ml新的消化液，輕輕搖動后再倒掉大部分消化液，僅留少許進行消化。消化2～5分鐘后把培養瓶置于倒置顯微鏡下進行觀察，發現胞質回縮，細胞間隙增大后，立即加入含血清的培養液終止消化。用吸管吸取瓶內培養液，反復吹打瓶壁細胞，使之成為單細胞懸液。將得到的細胞懸液分瓶培養。按照1∶2比例傳代。

MyD88及姜黃素處理：將培養的HSC-T6細胞分為對照組、MyD88組、姜黃素組、MyD88+姜黃素組，采用MyD88 siRNA對MyD88組、MyD88+姜黃素組進行干擾，48h后再加入姜黃素進行干擾24h。

1.3 指標檢查方法 Western印跡檢測蛋白表達：采用胰酶消化離心生長至對數期的HSC-T6細胞細胞，并加入細胞裂解液，反復吹打細胞混液使裂解液充分作用，30min后對其進行離心取上清液，Bradford法對上清液進行蛋白定量處理，取上清液0.05ml與0.1mlSDS混勻后再加入4倍體積的PBS溶液，加熱至沸騰變性；將變性蛋白進行凝膠電泳處理后用5%脫脂奶粉封閉轉好的PVDF膜1h，加入已孵育好的一抗，過夜，洗膜，加入二抗后孵育120min，顯影，最后用Quantity One4.6.2軟件分析目的條帶的灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與相應的GAPDH條帶灰度值的比值，作為目的蛋白的相對量，用于統計學分析。將每小組3個樣本的對應結果計算后，取平均值。

流式細胞術檢測細胞凋亡：取相同量的細胞混懸液，離心5min（1200r/min）后棄上清液，向各組中分別加入200μl的PBS溶液并輕輕混勻，然后依次加入AnnexinV-FITC染液和碘化丙啶(PI)各2μl，混勻后于37攝氏度溫箱內孵育15min，結束后加入200μl的PBS溶液上流式細胞儀進行檢測。

1.4 統計學方法 所有數據均采用SPSS19.0分析，計量資料采用t值檢驗，計數比較卡方x2檢驗，檢驗標準α=0.05，當P<0.05表示有統計學意義。

附表1 實驗材料及來源統計表

附表2 四組細胞的MyD88表達水平對比

附表3 四組細胞的凋亡率對比

2 結果

2.1 四組細胞之間的MyD88表達水平MyD88組灰度比值為（0.472±0.022），姜黃素組灰度比值為（0.585±0.037），M y D 8 8+姜黃素組灰度比值為（0.184±0.039）、對照組灰度比值為（0.968±0.085），四組之間的統計學比較見附表2。

2.2 四組細胞凋亡率比較 MyD88組凋亡率為（8.389±1.131），姜黃凋亡率為（27.185±6.032），MyD88+姜黃素組凋亡率為（40.286±10.029）、對照組灰度比值為（7.927±1.025），四組之間的統計學比較見附表3。

3 討論

肝星狀細胞是肝纖維化過程中的關鍵細胞，而姜黃素具有良好的抗肝纖維化作用，目前對其作用機制的認識尚處于理論階段，主要認為與以下幾點關系密切：①姜黃素能降低多種膠原（Ⅰ～Ⅳ型）的表達同時能促進這些膠原的降解；②姜黃素可以抑制TIMP-1的表達，該因子的主要作用是促肝纖維化細胞因子的表達；③姜黃素能促進肝星狀細胞的凋亡[3][4]。其中促進肝星狀細胞的凋亡是其發揮主要可能機制是姜黃素能夠抑制星狀細胞Ⅰ型膠原蛋白α1的表達以及其他一系列的信號通路的改變，Toll樣受體通路（TLR）占主要作用。目前主要認為TLR激活后能夠導致NF-κB活化，而在TLR活化NF-κB的過程中，最主要的作用物質是MyD88。本研究即從此出發探究MyD88對姜黃素促進肝星狀細胞凋亡效果的影響。

結果發現，采用MyD88 siRNA、姜黃素、MyD88+姜黃素對星狀細胞進行干擾后，細胞的MyD88表達水平均降低，同時MyD88 siRNA、姜黃素單獨應用時均不如MyD88+姜黃素的抑制作用強；而在對星狀細胞凋亡的影響作用上，姜黃素組、MyD88+姜黃素組的細胞明顯凋亡（P<0.05），而MyD88組未出現明顯凋亡（P>0.05），姜黃素組、MyD88+姜黃素組比較，MyD88+姜黃素組的凋亡率更高（P<0.05）。

總之，在肝星狀細胞降低MyD88的表達有助于提高姜黃素對其凋亡的促進作用。